Effetto delle condizioni climatiche su contenuto fenolico, profilo antocianico e attività antiossidante in cultivar di uva da vino (Vitis vinifera L.)

Introduzione

Il cambiamento climatico in atto negli ultimi anni desta preoccupazione e profondo interesse in considerazione del suo impatto sulla produzione agricola, compresa l’uva da vino. Nella viticoltura e nella produzione di vino, il clima è probabilmente il fattore più critico che influenza la maturazione dei frutti (Soar et al. 2008). Diventa quindi fondamentale adottare strategie in grado di far fronte alle nuove esigenze colturali sulla base dei cambiamenti climatici, preservando la qualità delle produzioni.
Le uve da vino devono in gran parte la loro qualità al contenuto di polifenoli per il ruolo che svolgono nel conferire qualità ad un vino in termini di colore, astringenza, amarezza (Eyduran et al., 2015). Inoltre, questi composti bioattivi sono responsabili di effetti benefici sulla salute umana (Tutino et al., 2020). Questi composti agiscono principalmente come antiossidanti con diversi meccanismi: donatori di idrogeno, chelanti metallici (riducendo gli ioni ferrici e rameici), inibitori enzimatici e up-regolatori del sistema di difesa antiossidante nel corpo umano (Georgiev et al. 2014).
La sintesi e la composizione dei polifenoli nell’uva dipende molto dal genotipo, dalle condizioni agronomiche e climatiche che, prese insieme, rappresentano il concetto di terroir (Van Leeuwen et al., 2016; Sgubin et al., 2019).

In questo contesto, l’analisi di variabili climatiche quali temperatura, precipitazioni o umidità, insieme ad una serie di indici bioclimatici derivati, può aiutare a capire quanto queste possano incidere sul contenuto di polifenoli e relative frazioni. La letteratura riporta diversi indici geoclimatici basati su dati meteorologici idonei per una caratterizzazione ambientale accurata. Tonietto e Carbonneau (2004) hanno proposto un sistema di Classificazione Climatica Multicriteria (MCC) basato su tre indici sintetici e complementari:

1) Indice Eliotermico di Huglin (HI) (Huglin, 1978); e
2) Cool Night Index (CI) (Tonietto, 1999), entrambi basati sulla temperatura dell’aria che influenza fortemente le principali fasi fenologiche della pianta e di conseguenza parametri produttivi e qualitativi come la composizione dei frutti;
3) Indice di Secchezza (DI) (Riou et al., 1994), basato principalmente sulle precipitazioni e sul tasso di Evapotraspirazione (Et0), tenendo anche conto che lo stress idrico moderato conferisce qualità alle uve da vino migliorando composizione chimica della bacca, inclusi zuccheri, acidi, fenoli e altri composti aromatici (Miràs-Avalos e Intrigliolo, 2017).

Altri indici possono anche aiutare a caratterizzare uno scenario climatico come i Growing Degree Days (GDD) che misurano l’accumulo di calore e il Diurnal Temperature Range (DTR). È noto che le differenze termiche giorno/notte, e in particolare le temperature notturne fresche, influenzano la sintesi dei polifenoli e degli antociani, soprattutto durante i periodi di maturazione (invaiatura) (Tonietto e Carbonneau, 2004), accelerando l’accumulo di antociani nelle bacche e l’inizio dell’invaiatura (Gaiotti et al., 2018).
L’area geografica in cui si è svolta questa ricerca è stata classificata da Dal Monte et al. (2019) di MCC sulla base di serie storiche pluriennali di dati meteorologici. In dettaglio, “Terre dell’Alta Val d’Agri”, è un’area viticola della Basilicata, nel sud Italia, situata al centro del III centro di domesticazione della vite (Del Lungo et al. 2016). Il sito è stato interessato, negli anni, da diverse attività di ricerca svolte sul recupero e valorizzazione del germoplasma della vite da vino dal nostro gruppo di ricerca (Alba et al. 2016). Abbiamo notato che in questa area geografica i vecchi viticoltori locali coltivavano vitigni storicamente coltivati in altri territori italiani. Tra questi, quattro varietà di uva da vino hanno attirato la nostra attenzione, vale a dire “Carignano”, “Castiglione”, “Lambrusca di Alessandria” e “Negroamaro”. Il Carignano è di origine spagnola, anche la sua coltivazione è diffusa in Francia, Argentina, Sardegna e Centro Italia (Pl@ntGrape 2009-2011). Il “Castiglione” è un’antica e importante cultivar a bacca nera coltivata in Calabria-Sud Italia, anche se la sua origine è sconosciuta (Sunseri et al. 2018). La “Lambrusca di Alessandria” è una cultivar di vino diffusa nella regione Piemonte del Nord Italia, e anche in questo caso esistono citazioni che fanno risalire la sua coltivazione in questa zona ai secoli XVIII e XIX (Raimondi et al. 2014). Il Negroamaro è ampiamente coltivato nella regione Puglia, si adatta molto bene ai climi caldi e secchi, a volte anche estremi, del Salento e dell’arco ionico (de Palma et al. 2012). La lontana origine geografica e genetica di queste cultivar può rappresentare una base di studio per la comprensione di come i diversi genotipi rispondono alle variazioni di campo e ambientali (climatiche).

Questo studio ha lo scopo di esaminare come la variazione climatica, in termini di temperatura e variazioni di pioggia nel corso dei tre anni, può influenzare il contenuto fenolico totale (TPC), il contenuto totale di antociani (TA), la composizione degli antociani e l’attività antiossidante (AA), in quattro cultivar di vino (‘Carignano’, ‘Castiglione’, ‘Lambrusca di Alessandria’, ‘Negroamaro’) coltivate nella Denominazione di Origine Protetta (DOP) “Terre dell’Alta Val d’Agri”.

Materiale e metodi

Area di studio, materiale vegetale e dati climatici
La presente indagine è stata condotta su quattro cultivar di Vitis vinifera L. (“Carignano”, “Castiglione”, “Lambrusca di Alessandria”, “Negroamaro”) presso il campo sperimentale Bosco Galdo dell’Agenzia Lucana per lo Sviluppo e l’Innovazione in Agricoltura (ALSIA), situata nel centro dell’Alta Val d’Agri in Basilicata (LAT 40°20’58”N, LON 15°49’43”E, alt.592 m slm), su viti innestate nel 2012 su 1103 Paulsen con un sesto d’impianto di 2,5 m × 0,80 m. Le uve sono state vendemmiate nell’estate 2014, 2015 e 2017 mentre nel 2016 problemi tecnici hanno impedito di monitorare la prova.
Le temperature massime e minime giornaliere (Tmax e Tmin) e le precipitazioni cumulate dal 2014 al 2017 sono state registrate dalla rete agro-meteorologica di ALSIA.
Per la classificazione climatica multicriterio (MCC) l’indice eliotermico (HI), l’indice di freschezza notturna (CI) e l’indice di secchezza (DI) sono stati calcolati in base a quanto riportato da Tonietto e Carbonneau (2004).

I Growing Degree Days (GDD) sono stati calcolati come segue:
XXXXXX (Tbase = 10°C. Giorni con GDD <0 sono stati considerati 0

Il Diurnal temperature range (DTR) è stato calcolato come segue: DTR = Tmax − Tmin

Estrazione del campione d’uva e analisi chimiche
100 bacche congelate di ogni varietà sono state sbucciate manualmente e 0,5 g di buccia sono stati impiegati per l’estrazione di polifenoli e antociani. Il TPC è stato determinato utilizzando il metodo descritto da Waterhouse (2002). La determinazione dell’AT è stata eseguita utilizzando un protocollo a pH differenziale come proposto da Lee et al. (2005).
I cinque antociani 3-O-glucoside (3-O-glc) (Cyanidin 3-O-glc, Delphinidin 3-O-glc, Petunidin 3-O-glc, Peonidin 3-O-glc, Malvidin 3-O- glc) sono stati analizzati con un cromatografo liquido Agilent 1100, dotato di un rivelatore a serie di diodi (DAD) (Agilent Technologies, Palo Alto, USA). La separazione è stata eseguita su una colonna C18 Zorbax SB (250×4,6 mm, impaccamento 5µm Agilent) con una precolonna Gemini C18 (4x2mm d.i., impaccamento 5µm; Phenomenex) entrambe termostatate a 22°C. Gli antociani sono stati identificati in base al loro tempo di ritenzione, le caratteristiche UV-visibili sono state ottenute da standard di riferimento e dati riportati in bibliografia (Spayd et al.2008, De Rosso et al. 2012). I risultati sono stati espressi come equivalenti di milligrammi di malvidina-3-O-glucoside per grammo di bucce (mg mv/g di buccia).

Attività antiossidante (AA)
L’analisi della capacità di assorbimento dei radicali dell’ossigeno (ORAC) è stata eseguita secondo il metodo di Ou et al. (2002). Il saggio DPPH (2,20-difenil-1-picrylhydrazyl) è stato condotto secondo Brand-Williams et al. (1995) con alcune modifiche. Il saggio ABTS (acido 2,20-azinobis-3-etilbenzotiazolin-6-solfonico) è stato condotto secondo Miller et al. (1993) con alcune modifiche.

Analisi statistica
I dati sono stati sottoposti ad ANOVA a due fattori, Cultivar (C) e Anno (Y) e relativa interazione, oltre alla composizione % della varianza.La correlazione tra composti fenolici e attività antiossidante degli estratti d’uva è stata valutata mediante il Coefficiente di correlazione per ranghi di Spearman. L’analisi delle Componenti Principali è stata eseguita per osservare come le diverse annate hanno influenzato la variazione della composizione antocianica tra le cultivar. Le analisi dei dati sono state condotte con il software Statgrafics centurion XVI.I.
 

Risultati e discussione

Analisi del clima
Il vigneto è situato al centro dell’Alta Val d’Agri in Basilicata e, in accordo con il Sistema Géoviticulture MCC (Tonietto e Carbonneau, 2004), il suo clima è stato precedentemente caratterizzato da Dal Monte et al. (2019) sulla base di una serie trentennale di dati meteorologici. Gli autori hanno registrato un indice eliotermico (HI) >2100 < 2400 (classe H+1), un indice di freschezza notturna (CI) <12 (classe CI+2) e un indice di secchezza (DI) <50 > −100 (DI + 1), descrivendo un clima temperato caldo, con notti molto fresche e clima moderatamente secco.

In base alla classificazione annuale del MCC (Tab. 1), CI è rimasta negli anni classificata come “notti molto fresche”, sebbene il suo valore sia progressivamente sceso sotto i 10 °C di anno in anno. Al contrario, HI è stato più basso nel 2014, ma ha raggiunto valori più alti per i successivi due anni, spostando l’indice da “temperato caldo” a “caldo”. Analogamente, DI ha raddoppiato i propri valori nel 2015 e nel 2017 rispetto al 2014, passando da “moderatamente secco” a “molto secco”. Il 2014 è risultato un anno molto più simile alla classificazione MCC del periodo 1985-2010, mentre i restanti due anni 2015 e 2017 si sovrappongono completamente alla classificazione MCC del periodo 2011-2018. Il sistema MCC, inoltre, confronta i dati dell’area investigata con altri areali classificati dal sistema ed ha evidenziato, in particolare nel 2014, un clima paragonabile a un sito argentino situato nella regione di Mendoza/Valle de UCO, con un’altitudine media di 1000 m slm. Nel 2015 e 2017, invece, il confronto è stato con un altro sito argentino situato nella Regione Patagonia//Neuquén – Valles del Rìo, con un’altitudine media di circa 250 m slm, evidenziando così come il clima dell’area di indagine si sia spostato verso una classificazione MCC caratterizzata da una maggiore siccità, tipica dei climi mediterranei piuttosto che dei continentali. Ciò è più evidente se si considerano le precipitazioni cumulate per quanto riguarda la Stagione di Crescita (GS), per la quale il 2014 è stato più piovoso degli altri anni, peraltro abbastanza simili tra loro. Al contrario, considerando l’anno solare (CY), il 2015 ha registrato una piovosità più elevata anche se in riferimento al GS è risultata quasi simile al 2017. Pertanto, indipendentemente dalle precipitazioni CY, la piovosità GS è importante perché gli indici climatici sono spesso calcolati per i periodi vegetativi (01 aprile – 30 settembre), quando l’acqua rappresenta un fattore limitante nel determinare l’insorgere delle diverse fasi fenologiche di una cultivar di uva. Ciò è evidente considerando la Figura 1, in cui sono riportati i diagrammi climatici di Walter-Lieth per un singolo anno e dell’intero periodo di prova. Il diagramma considera insieme la T media mensile e le precipitazioni di un determinato periodo/anno e le riporta su un grafico in cui il rapporto degli assi X e Y è 2mm/ºC fino a 50°C e 100 mm, limite oltre il quale il rapporto riduce la scala e va a 20 mm/ºC.

Nel dettaglio, nei tre anni ci sono stati periodi di siccità, tre nel caso del 2014 e del 2017 (da metà aprile a inizio ottobre), uno unico e più lungo nel 2015, in cui tuttavia c’è stato un controbilanciamento in termini di piovosità tra gennaio a fine marzo e un altro più breve ad ottobre. Altri periodi umidi in Fig. 1 sono evidenti nel 2017 (novembre), ma normalmente, considerando il periodo 2014-2017, l’area di indagine non evidenzia periodi umidi. Ad ogni modo, se si esclude il 2017 in cui si è verificato un periodo piovoso nel mese di giugno, come previsto i periodi siccitosi coincidono con l’incedere delle fasi fenologiche della vite con un picco ad agosto, cioè dopo l’invaiatura.

Per quanto riguarda la temperatura, il 2017 ha registrato il Tmin più basso sia per CY che per GS, probabilmente per il verificarsi di eventi estremi rispetto agli altri anni, come il nr. di giorni con T<0°C o >35°C. Questi indici hanno mostrato anche un andamento della temperatura più mite e stabile nell’annata 2014, durante la quale gli eventi estremi sono stati meno frequenti, il DTR è risultato inferiore rispetto agli altri anni e il GDD ha mostrato valori simili tra CY e GS. Inoltre, entrambi i valori ottenuti nel 2014 sono abbastanza simili al GDD in GS nel 2017, mentre considerando il CY, il GDD nel 2017 è stato il più basso. Inoltre, le temperature più fredde registrate nel 2015 e nel 2017 sono evidenti quando si confronta il GDD durante CY e GS, con differenze tra i due periodi di riferimento rispettivamente intorno a 300 e 400 GDD.

Pertanto, come riportato da Cohen et al. (2012), le alte o le basse temperature conferiscono una tipica variabilità dell’annata rispetto ad un valore stagionale definito. Inoltre, l’aumento di eventi climatici estremi influenza notevolmente la variabilità climatica annuale, rendendo difficile fare scelte previsionali in termini di gestione del vigneto durante la stagione vegetativa (Piña-Rey et al., 2020).

Polifenoli totali, profilo antocianico e attività antiossidante
Per gli anni 2014, 2015 e 2017 sono stati determinati il TPC e il TA e i principali antociani di quattro vitigni da vino (Carignano, Castiglione, Lambrusca di Alessandria, Negroamaro). Tab. 2 riporta l’ANOVA a due vie su dati standardizzati, insieme alla componente % di varianza data dai due fattori Anno (Y), Cultivar (C) e dalla loro interazione. Tutte le variabili valutate sono risultate significativamente influenzate da entrambi i Fattori e dalla loro interazione, ma il maggior contributo alla loro varianza è dovuto all’effetto dell’annata. In particolare, il contributo della varianza a TPC e TA per annata è risultato rispettivamente del 77,3% e dell’84,7%, mentre il contributo delle cultivar è stato molto più basso. Analogamente, il profilo degli antociani è maggiormente influenzato dall’annata ad eccezione della cianidina, influenzata prevalentemente dalla cultivar (67,3%). In particolare, Castiglione e Carignano hanno subito un incremento significativo, superiore a quello di Negroamaro e Lambrusca. Come previsto, sono stati individuati in tutte le varietà i cinque principali antociani 3-O-glucoside, con Malvidina 3-O-glc che rappresenta la frazione maggiore. Le bucce del “Castiglione” contenevano il più alto contenuto di Malvidina rispetto alle altre varietà. Il “Negroamaro” è risultato il più ricco di Cianidina-3-O-gl in tutte le annate. Per quanto riguarda l’andamento dei singoli antociani, negli anni è stato evidente un aumento della loro concentrazione per tutte le cultivar ad eccezione della Lambrusca, che ha mostrato valori più alti di delfinidina, cianidina, petunidina e peonidina nel 2015, subendo invece un calo nel 2017, anno in cui solo la malvidina è aumentata. Poiché il contenuto di TA di Lambrusca è aumentato nel 2017, ma i singoli composti sono diminuiti ad eccezione della malvidina, si può presumere che siano stati trasformati in forme più stabili (ad esempio antociani metossilati e acilati), che non abbiamo analizzato nel nostro lavoro. Ciò indica che l’effetto del clima sul profilo degli antociani può cambiare in base al genotipo, confermando che il profilo degli antociani è determinato principalmente da fattori genetici, sebbene fattori ambientali possano alterare questo profilo (Canuti et al., 2018). La tabella 3 mostra i coefficienti di correlazione di Spearman tra TPC, TA, antociani e AA come ORAC, ABTS e DPPH. La standardizzazione dei dati e l’uso di un approccio statistico non parametrico basato sui ranghi è stato privilegiato per la sua minore sensibilità agli outlier rispetto ai coefficienti di Pearson. Questo ha permesso di considerare contemporaneamente tutti gli anni di prova, a differenza di altri studi che riportavano dati relativi ad uno o al massimo due anni di raccolta (Farhadi et al. 2016, Lingua et al. 2016). Tutte le correlazioni sono risultate significative ad eccezione della Cianidina. È stato osservato un coefficiente di correlazione di circa >0,9 tra TPC, TA con ORAC e ABTS, indicando una relazione molto forte. Sono stati osservati anche forti correlazioni (0,74 < r < 0,86) tra TPC, TA e DPPH. Tra le frazioni analizzate, solo la Cianidina non ha mostrato correlazione con i tre saggi (ORAC, ABTS e DPPH), probabilmente perché questo composto ha mostrato la concentrazione più bassa, mentre Delphinidina 3-O-glc, Petunidina 3-O-glc e Malvidina 3-O-glc sono risultati significativamente correlati. Più moderata, invece, è risultata la correlazione della Peonidina 3-O-glc. I dati complessivi hanno suggerito che tutti e tre i saggi utilizzati nel nostro studio sono idonei a caratterizzare la capacità dei composti bioattivi dell’uva nel contrastare l’azione dei radicali tossici. Inoltre, i nostri risultati illustrano che l’AA è maggiormente correlata ai costituenti totali che alla concentrazione del singolo composto, confermando un effetto sinergico dei composti fenolici (van Breda e de Kok 2018).

Correlazione tra caratteri di qualità e parametri climatici
L’Analisi delle Componenti Principali (PCA) è stata proposta per visualizzare meglio il maggior effetto delle annate nel discriminare le cultivar ed è stata utilizzata per dimostrare la correlazione tra i parametri climatici valutati nei tre anni e il loro effetto sui tratti qualitativi (TPC, TA, profilo antocianico, AA) mediante analisi multivariata (Fig. 2). Le prime due PC spiegano l’86,1% della varianza totale indagata, con PC1 che da sola descrive il 64,1% della varianza. Le cultivar si raggruppano per annata, confermando che le fluttuazioni climatiche tra le stagioni possono portare a differenze qualitative rilevanti tra i vini prodotti da uve della stessa cultivar (Crespo et al. 2017). In dettaglio, GDD, HI e precipitazioni sono risultati negativamente correlati con profili fenolici e AA. Come sopra descritto (Tab. 1), nel 2014, l’annata più piovosa durante GS (296,2 mm di pioggia), si sono avuti i più bassi livelli di TA e TPC, con HI classificato come “temperato caldo” e GDD superiore al 2015 e 2017, considerando il CY. Al contrario, il 2017 è stata l’annata con il più alto accumulo di TPC e TA nelle bucce, con l’HI classificato come “caldo” e precipitazioni ridotte (182,8 mm). I nostri risultati sono in linea con altre ricerche (Rajha et al., 2017; Biniari et al., 2020; Yan et al 2020), che hanno confermato come temperature diurne più elevate, nel nostro caso rilevate da GDD e HI, diminuiscono l’accumulo di antociani, suggerendo un forte effetto della temperatura giornaliera sulla biosintesi e/o degradazione degli antociani (Cohen et al., 2008). La concentrazione finale di antociani dipende quindi dal contrappeso tra la sua sintesi e degradazione, quest’ultima stimolata da alte temperature (Liu et al 2018).

La PCA ha anche rivelato che DTR è correlato positivamente con TA, TPC e AA indipendentemente dalle cultivar. Questo indice tiene conto della differenza tra le temperature giorno/notte ed è fortemente influenzato dal verificarsi di eventi estremi come nr. Giorni T<0°C e nr. Giorni T>35°C. Nel 2014 il DTR è risultato inferiore rispetto agli altri anni con un andamento della temperatura più mite e stabile, invece il 2017 ha avuto il DTR più alto, registrando Tmin più basse e il più alto nr. di eventi estremi. Studi precedenti hanno riportato che una maggiore differenza tra le temperature giorno/notte, a causa delle temperature notturne più basse, favorisce l’accumulo di antociani (Gaiotti et al., 2018). Inoltre, la PCA ha evidenziato che il profilo fenolico è correlato negativamente con CI, cioè più alte sono le temperature minime medie di settembre (fine maturazione delle bacche), minore è l’accumulo di TPC, TA, antociani e di conseguenza AA. Il 2014 ha avuto il valore CI più alto (11,8 °C) rispetto al 2015 e al 2017 (9,8 °C e 8,6 °C rispettivamente). I nostri risultati sembrano essere in disaccordo con Gaiotti et al., (2018), che hanno riportato come la capacità di biosintesi degli antociani venga potenziata da notti fresche solo durante l’invaiatura, mentre risulti inefficace da questo momento fenologico in poi.

D’altra parte, la PCA ha rivelato un DI correlato negativamente con TA, TPC e AA. DI ha raddoppiato i suoi valori nel 2015 e nel 2017 rispetto al 2014, passando da “moderatamente secco” a “molto secco”. È stato dimostrato che la riduzione della disponibilità idrica dovuta alla minore piovosità, che si traduce in un moderato stress idrico, migliora i parametri di qualità dell’uva, TPC e AA (Garrido et al., 2016).

Conclusioni

Il presente studio ha evidenziato gli effetti del clima sul contenuto fenolico e sull’attività antiossidante di quattro cultivar di uva da vino. Le elevate differenze termiche giorno/notte combinate con i bassi livelli di precipitazioni osservate nella zona di Villa d’Agri nel corso del 2017, sono state di grande importanza per stimolare la sintesi di polifenoli e antociani nelle uve. Al contrario, è stato rilevato l’effetto negativo delle temperature elevate sull’accumulo di antociani. È emersa una forte e significativa interazione tra annata e genotipo, che sta alla base di come alcune cultivar affrontano migliori fluttuazioni climatiche da un anno all’altro rispetto ad altre. In particolare, il ‘Castiglione’, il ‘Carignano’ e la ‘Lambrusca di Alessandria’ sembrano adattarsi meglio al contesto pedoclimatico della regione viticola lucana rispetto al ‘Negroamaro’ che, si ricorda, è largamente coltivato nell’Italia meridionale e in particolare nel Salento (regione Puglia), con caratteristiche climatiche in realtà molto diverse rispetto all’area geografica in cui è stata condotta la ricerca.

Inoltre, è stato confermato che i test DPPH, ORAC e ABTS rappresentano uno strumento efficace per valutare l’AA delle uve da vino in relazione al loro contenuto di TPC e TA, in particolare per il contributo di delfinidina, malvidina e petunidina.

Annex