Aplicación de la metabolómica-qRMN para la autenticidad y discriminación de los procesos de vinificación

Inès Le Mao¹, Gregory Da Costa¹, Jean Martin¹, Eric Pedrot¹, Soizic Lacampagne¹, François Guyon², Tristan Richard^1*
1Université de Bordeaux, Œnologie EA 4577, USC 1366 INRA, INP, ISVV, 210 chemin de Leysotte, 33882 Villenave d'Ornon, France
²Service Commun des Laboratoires, 3 Avenue du Dr. Albert Schweitzer, Pessac Cedex, France
*Corresponding author: tristan.richard@u-bordeaux.fr

Artículo extraído de la presentación realizada durante Enoforum Web Conference (23-25 ​​febrero 2021)

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Resumen

La metabolómica por qNMR aplicada al vino ofrece muchas e interesantes posibilidades de aplicación. La aplicación principal, a la que se han dedicado numerosos estudios, es la autenticación de vinos a través de factores ambientales como el origen geográfico, la variedad de uva o la añada (Gougeon et al., 2019). Otro enfoque menos común es el estudio, desde un punto de vista cualitativo, de las diversas prácticas enológicas utilizadas durante la elaboración de los vinos. El objetivo de este trabajo era evaluar si la RMN cuantitativa podría utilizarse para disociar los procesos físicos o químicos comúnmente utilizados en enología. La finalidad era proporcionar una mejor comprensión de las interacciones entre los procesos enológicos y el vino mediante la determinación de los metabolitos responsables de la diferenciación a través de huellas dactilares 1H-NMR y quimiometría.  

Se cuantificaron unas 40 moléculas en muestras de vino que habían sido sometidas a varios procesos físicos y químicos. Se realizaron Análisis de Componentes Principales (PCA), Análisis Discriminante de Mínimos Cuadrados Parciales (PLS-DA) y S-score para la discriminación analítica de los procesos de vinificación.

Los resultados obtenidos muestran que la qRMN combinada con la quimiometría permite disociar no solo procesos físicos como la filtración, sino también químicos como la temperatura de maceración, tratamiento enzimático y clarificación. Además, también se podrían determinar los metabolitos implicados en la discriminación de estos procesos de vinificación.

La metabolómica 1H-NMR es una técnica rápida que podría utilizarse como herramienta para ayudar a los profesionales a decidir itinerarios técnicos.

Introducción

La resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica espectroscópica que desde hace 20 años se utiliza cada vez más para el análisis de alimentos. Sus propiedades no específicas y no selectivas hacen que sea una herramienta adecuada para la metabolómica, una ciencia reciente que estudia todos los metabolitos primarios y secundarios presentes en muestras biológicas. La RMN tiene muchas ventajas, incluida la capacidad de analizar simultáneamente diferentes familias de moléculas en un solo análisis sin preparación previa y a partir de un pequeño volumen de material. Además, es una técnica cuantitativa ya que el área de la señal es proporcional a la concentración de metabolitos detectados en el espectro. Esto se conoce como RMN cuantitativa (qNMR).

Aplicada al vino, la metabolómica por qNMR permite observar el impacto de diferentes parámetros en la composición química del vino, como por ejemplo la variedad de uva, el origen geográfico o la añada (Valls Fonayet et al., 2021). Actualmente se sabe que la RMN de protones es una técnica para distinguir vinos de diferentes regiones, variedades de uva y añadas (López-Rituerto et al., 2012; Godelmann et al., 2013; Gougeon et al., 2018). Estos trabajos han demostrado que la RMN es una herramienta eficaz para garantizar la autenticidad de los vinos. El fraude es un problema generalizado en la industria del vino. Para superar este problema se llevó a cabo la creación de una base de datos para recolectar una gran cantidad de muestras auténticas donde cada análisis es considerado como un carnet de identidad. Esta recolección permite elaborar un perfil para cada región, variedad de uva o añada. Por lo tanto, si existe una sospecha de fraude, la muestra sospechosa se compara directamente con la muestra auténtica proporcionada por la bodega o se compara con un gran conjunto de datos.

Esta colección de datos ha evidenciado además que los espectros de RMN distinguen vinos no solo dentro de una misma región sino también dentro de la misma denominación y de bodegas a solo unos kilómetros de distancia. Estos resultados evidenciaron que el análisis medinat RMN, podría ser utilizado no solo para distinguir los parámetros ambientales, sino también para discriminar los procesos de elaboración del vino.

Basándonos en esta hipótesis, en este trabajo se estudiaron varios factores y procesos comúnmente utilizados en enología: termovinificación, filtración y uso de enzimas. El objetivo de este trabajo era proporcionar una mejor comprensión de las interacciones entre los procesos enológicos y el vino mediante la determinación de los metabolitos responsables de la diferenciación a través de la huella digital 1H-NMR y la quimiometría.

Material y métodos

La preparación de muestras y los análisis se realizaron como se describe en nuestro artículo anterior (Gougeon et al., 2019a). Brevemente, las muestras de vino se mezclaron con tampón de fosfato y solución de agua deuterada (proporción 7:2:1). La sal sódica del ácido trimetilsililpropanoico (TMSP) y el formiato de calcio se utilizaron como referencias de frecuencia y cuantificación, respectivamente. El pH se ajustó a 3,1 usando una unidad BTpH (Bruker BioSpin, Alemania). Los espectros de 1H-RMN se adquirieron con un espectrómetro de 600 MHz (Bruker BioSpin, Alemania). Se utilizaron dos secuencias específicas para la cuantificación de los compuestos del vino. Se utilizó el programa ZGPR pulse para la supresión de la señal de agua. Se realizó la secuencia NOESYGPPS1D para la supresión de señales de agua y etanol. Los espectros se procesaron con Topspin 3.2 (Bruker Biospin, Alemania) y se analizaron con MestReNova 12 (Mestrelab Research, España). Los espectros se sometieron a correcciones de fase y línea de base antes de la extracción de datos. Por último, los compuestos se cuantificaron semiautomáticamente utilizando el complemento Simple Mixture Analysis (SMA) del software MestReNova.

La comparación entre dos vinos se realizó utilizando un enfoque z-score adaptado que permite calcular una puntuación de similitud (puntuación s) para cada componente del vino (Gougeon et al., 2019b). Un A-s-score superior a 2,0 (intervalo de confianza del 95%) sugiere una diferencia significativa entre los dos vinos. Se utilizó el software SIMCA 16 (Umetrics, Suecia) para el análisis de componentes principales no supervisado (PCA) y el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA). El PCA se llevó a cabo en la primera etapa para visualizar los datos. En una segunda etapa, se completó con PLS-DA para afinar la discriminación entre conjuntos. 

Resultados y discusión

Espectroscopia ¹H-NMR

En la Figura 1 se muestra un espectro representativo del vino después de la supresión del agua y etanol. Los compuestos se identificaron mediante patrones químicos puros, experimentos 2D-NMR y datos bibliográficos (Fotakis et al., 2013). Hoy en día, se han identificado y cuantificado casi cincuenta componentes del vino, incluidos ácidos orgánicos, alcoholes, aminoácidos, compuestos fenólicos y azúcares (Gougeon et al., 2019a).

Para realizar una cuantificación precisa, los espectros 1H-NMR se exportaron a MestReNova 12 y se trataron con el complemento SMA (Gougeon et al., 2018). La deconvolución del pico se realizó utilizando el método de deconvolución espectral global (Cobas et al., 2011). La precisión del método se validó mediante comparación con muestras de referencia y con métodos oficiales de la OIV (Gougeon et al., 2019b).

Figura 1. Espectros ¹H-NMR representativos de una muestra de vino después de la supresión de la señal (A: supresión de agua usando la secuencia ZGPR; B: supresión de señales de agua y etanol usando la secuencia NOESYGPPS1D).

Autenticidad del vino

Para garantizar la autenticidad de un vino, se pueden utilizar dos enfoques. El primer enfoque es comparar directamente la muestra sospechosa con la muestra de la botella auténtica. Si se trata de un fraude, los dos espectros serán diferentes en composición (diferencias detectadas a nivel de las moléculas observadas) o en contenido (concentraciones de los diferentes constituyentes del vino). Para permitir la comparación de los datos y tener en cuenta la crianza del vino en botella, se ha desarrollado una herramienta estadística denominada s score (Gougeon et al., 2019b). Esta técnica se validó mediante la comparación de los análisis de vino habituales realizados con los métodos oficiales de la OIV y la metabolómica qNMR. En comparación con los métodos clásicos, la RMN podría reducir los volúmenes de vino requeridos y la duración del análisis como un primer enfoque del control de autenticidad de los vinos. Para ilustrar el proceso, la comparación de la puntuación s de un vino auténtico y falso con el vino de referencia proporcionado por la bodega se muestra en la Figura 2. Los vinos que presentan más de cuatro puntuaciones s superiores a dos podrían considerarse significativamente diferentes. 

Figura 2. Comparación de los valores de puntuación s de un vino falso (A) y uno auténtico (B). El vino de referencia fue proporcionado por la bodega.

La alternativa, cuando no se puede obtener una muestra auténtica, es comparar la muestra sospechosa con una base de datos. De hecho, sabemos que la composición del vino varía según la variedad de uva, la añada, el origen geográfico y las prácticas vitivinícolas. Así, la recogida de un gran número de muestras conduce a la elaboración de un perfil para cada denominación, región o variedad de uva. Cuando una muestra desconocida se confronta con la base de datos, podemos determinar su origen a través del análisis estadístico (Gougeon et al., 2019a). Para ilustrar la capacidad de la metabolómica qNMR de discriminar vinos, se compararon datos analíticos de vinos de diferentes cosechas de tres bodegas cercanas de Burdeos mediante análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA). Como se muestra en la Figura 3, los tres conjuntos de vinos se discriminan claramente durante un período de casi diez años.

Figura 3. Gráfico de puntuación de PLS-DA basado en análisis qNMR de vinos de tres bodegas cercanas de Burdeos (bodega A: círculo azul; bodega B: círculo rojo; bodega C: círculo verde) durante una década 

Discriminación de los procesos de vinificación

Se estudiaron tres procesos comúnmente utilizados en enología: termovinificación, filtración y adición de enzimas. Los resultados se presentan en la Figura 4.

La termovinificación es un proceso utilizado inicialmente para eliminar las lacasas producidas por Botrytis cinerea, responsables de defectos organolépticos. En este estudio, dos conjuntos de vinos elaborados mediante termovinicación o temperatura convencional se analizaron mediante metabolómica por qNMR. El gráfico de puntuación de PLS-DA (Figura 4A) muestra que las muestras termovinificadas son significativamente diferentes de las muestras vinificadas a temperaturas convencionales. El loading plot indica que las moléculas involucradas en la discriminación son: ácidos galacturónico, láctico, succínico y xilosa en los vinos termovinificados; y fructosa, prolina, colina y ácido acético en las muestras vinificadas a temperatura convencional. Estos resultados demuestran que la termovinificación no solo tiene un impacto sobre los compuestos fenólicos y el color del vino, sino también sobre otros compuestos como los ácidos orgánicos, los azúcares y los aminoácidos.

La filtración es un proceso posterior a la fermentación que contribuye a la clarificación y conservación de los vinos. Los vinos filtrados y sin filtrar se analizaron mediante metabolómica por qNMR. El gráfico de puntuación de PLS-DA (Figura 4B) muestra que los análisis de RMN discriminan las muestras filtradas de las muestras no filtradas. Las moléculas más afectadas por la filtración son los ácidos succínico y láctico, isobutanol, glicerol y acetoína. Estos datos sugieren que el proceso de filtración no solo afecta a las moléculas grandes sino también a las de bajo peso molecular.

Figura 4. Gráficos de puntuación y cargas de PLS-DA basados en análisis qNMR de vinos obtenidos con tres procesos de vinificación (A: termovinificación; B: filtración; C: adición de enzimas).

El uso de enzimas es una técnica frecuentemente utilizada para la clarificación y estabilización durante la vinificación. Los vinos con o sin adición de enzimas se analizaron mediante metabolómica por qNMR. Los resultados analíticos también muestran que este proceso tiene un impacto en el metaboloma del vino, ya que las muestras no tratadas son significativamente diferentes de las que se sometieron a la adición de enzimas (Figura 4C). Los gráficos PLS-DA muestran que las moléculas involucradas son: glucosa, ácido galacturónico, metanol, lactato de etilo, manitol, arabinosa y fructosa para muestras tratadas y catequina, histidina e isoleucina para muestras no tratadas. Esta es la primera vez que se identifican las moléculas afectadas por el uso de enzimas. De hecho, las diferencias se detectan generalmente por análisis sensorial pero nunca mediante análisis químico clásico.

Conclusión

Los resultados obtenidos demuestran la capacidad de la qRMN combinada con la quimiometría para discriminar vinos. Aplicada a los procesos de vinificación, la metabolómica por qNMR permite discriminar no solo procesos físicos como la filtración, sino también procesos químicos como la termovinificación y el tratamiento enzimático. Además, se pueden identificar los metabolitos implicados en la discriminación de estos procesos de vinificación. En conclusión, la metabolómica 1H-NMR es una técnica rápida que podría utilizarse como herramienta para ayudar a los profesionales a elegir los itinerarios técnicos más adecuados. 

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por el Conseil Interprofessionnel du Vin de Bordeaux (CIVB), Conseil Régional d'Aquitaine, programa FranceAgriMer (subvención número 2014–0785), Château Mouton Rothschild, Fondation of Bordeaux (Baron Philippe de Rothschild SA, Chateau Cheval Blanc , Château Lafite Rothschild, Le Domaine Clarence Dillon, Château Petrus) y Biolaffort. Los experimentos se realizaron gracias al programa Bordeaux Metabolome Facility y MetaboHUB (proyecto ANR-11-INBS-0010). 

Referencias

Cobas C., Seoane F., Domínguez S., Sykora S., Davies A.N., 2011. A new approach to improving automated analysis of proton NMR spectra through Global Spectral Deconvolution (GSD). Spectrosc. Eur. 23, 26-30.

Fotakis C., Kokkotou K., Zoumpoulakis P., Zervou M., 2013. NMR metabolite fingerprinting in grape derived products: An overview. Food Res. Int. 54, 1184-1194.

Godelmann R., Fang F., Humpfer E., Schütz B., Bansbach M., Schäfer H., Spraul M., 2013. Targeted and Nontargeted Wine Analysis by 1H NMR Spectroscopy Combined with Multivariate Statistical Analysis. Differentiation of Important Parameters: Grape Variety, Geographical Origin, Year of Vintage. J. Agric. Food. Chem. 61, 5610-5619.

Gougeon L., Da Costa G., Le Mao I., Ma W., Teissedre P.L., Guyon F., Richard T., 2018. Wine Analysis and Authenticity Using 1H-NMR Metabolomics Data: Application to Chinese Wines. Food Anal. Meth. 11, 3425-3434.

Gougeon L., da Costa G., Guyon F., Richard T., 2019a. 1H NMR metabolomics applied to Bordeaux red wines. Food Chem. 301, 125257.

Gougeon L., Da Costa G., Richard T., Guyon F., 2019b. Wine Authenticity by Quantitative 1H NMR Versus Multitechnique Analysis: a Case Study. Food Anal. Meth. 12, 956-965.

López-Rituerto E., Savorani F., Avenoza A., Busto J.H., Peregrina J.M., Engelsen S.B., 2012. Investigations of la Rioja terroir for wine production using 1H NMR metabolomics. J. Agric. Food. Chem. 60, 3452-3461.

Valls Fonayet J., Loupit G., Richard T., 2021. MS- and NMR-metabolomic tools for the discrimination of wines: Applications for authenticity, Adv. Bot. Res. 98, 297-357.