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Evaluación de la estabilidad de la quercetina: tratamientos enológicos y desarrollo de un índice de riesgo de precipitación

Francesca Borghini et al., ISVEA Siena

Francesca Borghini, Francesco Giordano, Leonardo Masoni y Stefano Ferrari
ISVEA srl. Via Basilicata s/n, Poggibonsi (Siena)
Contacto por correo electrónico: f.borghini@isvea.it

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INTRODUCCIÓN

La quercetina pertenece a la clase de los polifenoles, en particular de los flavonoides. Las más abundantes en el vino son la quercetina, la miricetina, el kaempferol y la isoramnetina, que proceden de las formas glicosídicas que se encuentran en los hollejos de las uvas y en los órganos verdes de la planta. Posteriormente, tras los fenómenos de hidrólisis que tienen lugar durante la vinificación, maduración y envejecimiento del vino, los flavonoles se liberan en sus formas agliconas que son menos solubles. Son compuestos de defensa que la vid sintetiza principalmente en respuesta al estrés UV y, al igual que los demás fenoles, tienen importantes propiedades biológicas, ya que poseen una elevada actividad antioxidante que impide la formación de radicales libres. Sin embargo, en el caso específico de la quercetina, se ha observado que puede dar lugar a un defecto en los vinos, especialmente en los vinos a base de uvas Sangiovese, incluso en los de gama alta, donde se pueden formar precipitados insolubles (Figura 1). La formación de precipitados puede tener lugar tanto en el tanque, mientras el vino está todavía en la bodega, como en la botella; en este último caso, al ser un defecto que aparece después del embotellado, puede provocar una depreciación del producto que se traduce en un daño económico para las bodegas.

Figura 1 Depósito de quercetina observado con el microscopio óptico.

Los primeros documentos en los que se menciona la quercetina se remontan a 1969, momento en el que aún no se conocían los mecanismos de formación de su sedimento hasta que, en 1985, Somers y Ziemelis analizaron un precipitado amarillo de quercetina en vinos blancos obtenidos de la vendimia mecánica. Su hipótesis es que esto se debe a la liberación en el mosto del rutinósido de quercetina, compuesto presente a altas concentraciones en las partes verdes de la vid (dado el gran número de hojas que se encuentran en la vendimia) y a la posterior hidrólisis de este compuesto en el vino, con la liberación de la aglicona. En los años siguientes, las señalaciones sobre la presencia de quercetina aumentaron considerablemente y procedían de ámbitos muy diferentes. La quercetina aglicona es un complejo inestable que tiende a precipitar en el vino si se encuentra en concentraciones superiores a 5 mg/L (Boulton, 2001). Sin embargo, puede encontrarse en cantidades superiores a su umbral de solubilidad debido a fenómenos de copigmentación con antocianos (Gutiérrez, 2005), donde se requiere la presencia de monómeros del pigmento para formar dichas estructuras estables en el medio. La hidrólisis de la quercetina glicosilada tiene lugar tras periodos de tiempo relativamente largos (Gambuti, 2020), y en el proceso de crianza y conservación puede sufrir succesivas hidrólisis debido a factores como el aporte de oxígeno y la temperatura, dando lugar a la formación de más sedimentos. Es difícil determinar un umbral por debajo del cual se puede considerar que un vino presenta un bajo riesgo de precipitación de quercetina, ya que la variedad, la gestión agronómica (Romboli et al, 2018), las prácticas de vinificación y de crianza tienen un gran impacto en su estabilidad. En los vinos estables, el contenido máximo de agliconas de quercetina es de unos 15 mg/L (Biondi Bartolini, 2018). Los estudios sobre la quercetina además se han desarrollado recientemente, impulsados principalmente por la búsqueda de soluciones operativas en el viñedo y la bodega, con el fin de resolver el problema de la formación de precipitados (Vendramin et al., 2022).

Hasta ahora, los tratamientos enológicos utilizados para eliminar la aglicona de la quercetina, y de esta forma conseguir que el vino se mantenga por debajo del umbral de riesgo de formación de precipitados, son físicos. Se utiliza polivinilpolipirrolidona (PVPP) y carbón vegetal activado. El PVPP es un producto enológico sintético, consistente en un polvo muy fino, que se utiliza en el proceso de clarificación y que tiene unas características químicas que le permiten unirse a las moléculas polifenólicas. Sin embargo, este producto no está incluido en el protocolo de producción de vino ecológico, y cualquier traza comprometería la clasificación del producto. Por otro lado, el uso de PVPP implica principalmente un empobrecimiento del producto tratado, ya que actúa disminuyendo significativamente la intensidad colorante del vino. En cuanto a los carbones enológicos, se trata de compuestos de origen vegetal. Su acción se basa en el fenómeno de adsorción superficial, por el que, gracias a fuerzas de atracción como las de Van der Waals, se retienen las moléculas más reactivas y afines (como antocianos y etilfenoles). El carbón vegetal está disponible en polvo, granulado o pellets, y su uso está regulado por el Reglamento UE 606/09, que establece expresamente que el tratamiento con carbón vegetal para uso enológico sólo está autorizado para los siguientes productos: mosto y vino nuevo aún en fermentación, mosto de uva concentrado rectificado, vinos blancos. Su uso está permitido para mejorar las características de ciertos mostos obtenidos a partir de uvas contaminadas por hongos como oídio y botritis, con el fin de eliminar los metabolitos contaminantes (por ejemplo, la ocratoxina A) y para mejorar el color en el caso de los vinos blancos. La adición de carbón desodorizante debe ir necesariamente asociada a una posterior filtración por membrana. Según el Reglamento europeo 934/19, el carbón desodorizante sólo puede utilizarse en vinos jóvenes, es decir, hasta el final del año natural de la cosecha. No obstante, el uso de estos productos puede provocar una disminución de ciertas características organolépticas, por lo que siempre es aconsejable, cuando se utilicen, evaluar la dosis mínima necesaria. En el caso de las bodegas ecológicas que se encuentran con el problema de la precipitación de quercetina, no es fácil encontrar una solución para su estabilización. Una posible estrategia para tratar el problema de la formación de precipitados de quercetina puede ser crear condiciones favorables para la hidrólisis temprana del glucósido, y eliminar el sedimento formado en el depósito antes de efectuar el embotellado. Esta estrategia puede llevarse a cabo mediante técnicas de oxigenación que pueden practicarse desde el trasiego y que, al intensificar el aporte de O2 al vino, reducen drásticamente la fracción aglicona y en parte la glucósida, favoreciendo su precipitación. En algunos ensayos realizados con aportaciones de alrededor de 6 mg/L de O2, el contenido de aglicona de quercetina se reducía hasta en un 50% (Gambuti, 2020). Las prácticas enológicas que pueden favorecer la estabilización de la quercetina son, entre otras, las siguientes

           a) uso de enzimas o levaduras con actividad glicosídica para favorecer la hidrólisis temprana de la quercetina glicosídica;

b) evitar la adición de taninos en las fases iniciales de la vinificación, ya que podrían formar complejos con los antocianos que por tanto no estaría disponibles para formar copigmentos con la quercetina;

c) el uso de barricas nuevas que permiten un elevado intercambio de oxígeno, asegurando una buena relación volumen/superficie de contacto, lo que podría favorecer la precipitación del aglicón durante la maduración;

d) la realización de ciclos de frío y calor induce la inestabilidad de los pigmentos y polímeros fenólicos en su estado coloidal, entre los que se encuentra la quercetina. Es necesario evaluar el impacto de esta práctica en la calidad sensorial del vino;

e)  mantener la concentración de anhídrido sulfuroso a niveles mínimos puede permitir la presencia de más antocianos monómeros disponibles para unirse a la aglicona de quercetina, haciéndola estable en el medio debido a los fenómenos de copigmentación;

f)  la realización de ensamblajes, siempre que esté permitido, con vinos con menor contenido de quercetina o alta carga polifenólica podría reducir el riesgo de precipitación;

g) En el caso de los vinos de riesgo medio, la adición de manoproteínas y taninos que actúan como coloides protectores mostrando una ligera oposición a la precipitación del exceso de quercetina (QUE-STAB, 2018).

En el marco del Proyecto Vintegro (Integridad y estabilidad del vino toscano), financiado por la Región Toscana en el marco del Programa de Desarrollo Rural 2014-2020 -convocatoria de propuestas para el "Apoyo a la ejecución de los Planes Estratégicos y al establecimiento y gestión de los Grupos Operativos de la Asociación Europea para la Innovación en materia de Productividad y Sostenibilidad Agrícola (PEI-AGRI)- se realizaron algunas pruebas de laboratorio y de bodega para comprobar qué condiciones y qué productos enológicos podrían afectar a la estabilidad de la quercetina en el vino.

En 2020, en el laboratorio ISVEA, Italia, se realizó un preciso perfilado analítico de una serie de vinos Sangiovese de diferentes añadas (2017-2019), para tratar de investigar las relaciones de la quercetina con los demás componentes de la matriz; al mismo tiempo, se realizaron pruebas de reducción del contenido de quercetina (aglicona y glucósido). Para los experimentos se utilizaron dos vinos con un contenido significativo de quercetina, que se dividieron en varias muestras (193 ensayos en total) y se trataron con diferentes tipos de productos enológicos comerciales (clarificantes, derivados de levadura, enzimas, polifenoles y otros productos), simulando prácticas de bodega y algunos métodos de embotellado. Una vez transcurrido el tiempo de conservación, se analizaron las muestras y se observaron diferencias debidas al tratamiento realizado. En 2021, tanto en el laboratorio como a escala de bodega, se probaron los productos disponibles en el mercado y aplicables a la producción ecológica.


MATERIAL Y MÉTODOS

Vinos

En la primera fase de cribado, se analizaron más de 50 muestras de Sangiovese de diferentes añadas 2017, 2018 y 2019.

Para llevar a cabo la experimentación, se analizaron dos vinos en fase de crianza aún sin embotellar, producidos con uvas Sangiovese puras, con una concentración de quercetina glucósido de 31 mg/L y 26 mg/L y de quercetina aglicona de 11 mg/L y 9 mg/L, respectivamente. Los dos vinos utilizados también mostraron similitudes en cuanto al contenido total de polifenoles. Los dos vinos fueron sometidos a pruebas que simulaban prácticas enológicas y adición de productos enológicos. Los vinos se analizaron 14 días después del tratamiento (Figura 2).  

 

Figura 2. Esquema de las principales etapas del ensayo 

Por otro lado, la muestra utilizada en 2021 tenía concentraciones de aglicona de quercetina de 10 mg/L, 15 mg/L de glucósido y 32 mg/L de glucurónido de quercetina.

Métodos de análisis

En todas las muestras se realizó un cribado general que incluía los análisis de control clásicos: acidez total, acidez volátil y pH, intensidad y tonalidad colorante, que se determinaron según los métodos de la OIV (OIV-MA-AS313-01, OIV-MA-AS313-02 y OIV-MA-AS313-15, OIV MA-AS2-07B respectivamente). Los polifenoles se analizaron midiendo las absorbancias a diferentes longitudes de onda, obteniendo: polifenoles totales (mg/L de ácido gálico); taninos totales (g/L); antocianinas totales (mg/L); y en unidades de absorbancia (U.A): antocianos libres, antocianos totales, complejos antociano-tanino, fenoles totales.

Los análisis de la quercetina se llevaron a cabo mediante el método de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC, Skoog D.A., Leary J.J., 1995). Se utilizaron dos instrumentos con detectores diferentes para obtener análisis separados, es decir, con el detector UV-VIS se obtuvieron los primeros datos sobre el glucósido y la aglicona de quercetina, mientras que con el espectrómetro de masas HRMS se investigaron las muestras consideradas más interesantes en función de las variaciones significativas de quercetina, analizando así las fracciones unidas al ácido glucurónico, la galactosa y la rutina.  

La muestra a analizar se filtró primero a 0,45 µm.

Productos enológicos

Las clases de productos utilizados para las pruebas son:

  • Enzimas: β- glucanas, pectolíticas y α e β-glucosidas
  • Derivados de la levadura: cortezas de levadura, levaduras inactivadas y manoproteínas
  • Polifenoles: Taninos y Antocianos
  • Clarificantes: proteína vegetal (proteína de guisante, códigos A-C-D-E-G-I-J-K, y proteína de patata, códigos B y H), PVPP, gelatina, carbón vegetal.
  • Clarificantes formulados: coadyuvantes para la clarificación que combinan el efecto de varios productos de forma sinérgica : A. Bentonita, polisacáridos y quitosano; B. Bentonita, carbón vegetal;
  • Formulado con composición no especificada por el fabricante; C. Derivados de levadura, quitosano y enzima ß-glucanasa; D. Bentonita y carbón vegetal; E. Bentonita, cola de pescado, gelatina animal, PVPP. Bentonita y carbón vegetal; E. Bentonita, cola de pescado, gelatina animal, PVPP
  • Otros: Metilcelulosa y tapón de corcho 
     

Plan experimental

El vino se dividió en botellas transparentes de 250 mL con tapones de plástico y se numeró previamente, correspondiendo cada número a un tratamiento o adición concreta. Se realizaron un total de 193 muestras. Antes de cerrar la botella, se introdujeron los distintos productos, previamente disueltos en 10 mL de agua destilada con la ayuda del vórtex, gracias al cual se pudo mezclar la solución a añadir de la mejor manera posible. Algunas muestras se añadieron con una alícuota del 50% de otro vino tinto o blanco con bajo contenido en quercetina. Tras la adición de los productos enológicos, las botellas se sometieron a diferentes tratamientos:

    - Temperatura ambiente (20°C, protegido de la luz y de los cambios de temperatura ambiental);

    - Tratamiento con frío (-4°C, conservado en nevera);

    - Tratamiento térmico (30°C, en cámaras climáticas sin y con luz UV continua);

    - Remontado al aire (20°C, protegido de la luz y de los cambios térmicos ambientales);

    - Remontado sin contacto con aire (20°C, protegido de la luz y de los cambios térmicos ambientales);

    - Adición de 20 g/hL de bentonita (20°C, protegido de la luz y de los cambios térmicos ambientales).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

CRIBADO DE LOS VINOS

Los resultados de los análisis de las 50 muestras de Sangiovese se estudiaron mediante técnicas estadísticas multivariantes y se resumen en la Figura 3. En función de todos los parámetros analizados, se observa una clara agrupación de las muestras: los vinos de 2017 se sitúan en el cuadrante superior izquierdo y se caracterizan por tener altas concentraciones de quercetina glicosídica y glucurónido, además de ser ricos en taninos; los vinos de 2019, en cambio, que se sitúan en el cuadrante opuesto, tienen altos niveles de quercetina aglicona.

El análisis de correlación (datos no mostrados) confirmó (QUE-STAB, 2018) correlaciones significativas y positivas entre la aglicona de quercetina y los antocianos y entre las formas unidas de las mismas con los taninos. A partir de estos resultados, se elaboró un índice para evaluar el riesgo de precipitación de la quercetina (Índice de Riesgo QUESTAB, Tabla 1), para cuyo cálculo es necesario determinar no sólo el contenido de aglicona y glicosidato de quercetina, sino también los taninos y antocianos presentes en la muestra.

Figura 3 - Análisis de componentes principales (PCA) de muestras de sangiovese 2017-2019.

 

Tabella 1 Índice de riesgo QUESTAB.


El índice se validó durante el segundo año del proyecto analizando no sólo todas las muestras del proyecto, sino también más de 800 muestras que llegaron al laboratorio.

Perfil de las quercetinas de los vinos

Las figuras 4 y 5 muestran los resultados obtenidos en los ensayos. El contenido de agliconas de quercetina de todas las muestras (Figura 4) muestra una tendencia bastante variable. De hecho, teniendo en cuenta que la línea de puntos indica el contenido del tal cual, en algunos ensayos la concentración disminuye considerablemente, mientras que en otros aumenta considerablemente.

Figura 4 Contenido de aglicona de quercetina en todas las pruebas realizadas.

El contenido de glucósido de quercetina (Figura 5) muestra disminuciones correspondientes a las variaciones en la aglicona. Si observamos la línea de puntos que indica el contenido de glucósidos de quercetina en el tal cual, esta fracción sólo se reduce, sin llegar a eliminarse por completo.

Figura 5 Contenido de glucósido de quercetina en todas las pruebas realizadas.

Sólo las muestras que mostraron diferencias significativas en la concentración de quercetina y glucósido de quercetina en comparación con el vino inicial se sometieron a un análisis más detallado por HPLC-HRMS. Los análisis de alta resolución permitieron estudiar las distintas fracciones de quercetina (aglicona de quercetina; glucósido de quercetina; galactósido de quercetina; glucurónido de quercetina y rutinósido de quercetina). De entre todos los productos a base de enzimas, la β-glucanasa no tuvo ningún efecto, mientras que ciertos pectolíticos y la α e β-glicosidasa mostraron variaciones significativas. La figura 6 muestra el contenido de quercetina en las tres formas (aglicona, glucósido y glucurónido) de las muestras tal cual y de las muestras con adición de enzimas, es decir, enzimas pectolíticas (Ep1= N.127; Ep2= N.129), enzimas α y β-glicosidasa (Eg1= N.50; Eg2= N.188) y una mezcla de enzimas pectolíticas y α y β-glicosidasa (Ep+Eg= N.134). Hay un aumento de la aglicona de quercetina, con la correspondiente disminución de la fracción de glucósido y especialmente del glucurónido.

Figura 6 Contenido de quercetina (en mg/mL) de las muestras tratadas con enzimas pectolíticas (Ep1, Ep2), α y β-glicosidasa (Eg1, Eg2) y una mezcla con ambos tipos (Ep+Eg).

En 2021, se probó un producto enzimático aplicable en las producciones ecológicas, tanto en laboratorio como a escala de bodega. La figura 7 muestra los resultados del ensayo en la bodega, donde el tanque tratado fue muestreado aproximadamente cada 15 días. Al cabo de un mes, la concentración de quercetina combinada (con el ácido glucurónico y con la glucosa) se redujo significativamente, mientras que se observó un gran aumento de la fracción de agliconas.

Figura 7 Contenido de aglicona y quercetina combinada (en mg/mL) de las muestras tratadas con la enzima pectolítica en la bodega.

Teniendo en cuenta los clarificantes, las fluctuaciones en los niveles de quercetina se observan principalmente en los tratamientos con PVPP (nº 22) y carbón vegetal (Carb 1= nº 114; Carb 2= nº 126), que determinaron una considerable reducción de la aglicona, confirmando su acción ya conocida (Figura 8). El segundo carbón en particular (Carb 2), redujo completamente la concentración de aglicona.

Figura 8: Contenido de quercetina en muestras con clarificantes como PVPP y carbones vegetales (Carb 1, Carb 2).

En conclusión, por lo que respecta a los ensayos realizados y los resultados obtenidos, algunos tratamientos y adiciones resultaron eficaces a la hora de provocar cambios en el contenido de quercetina. El ensamblaje con vinos con menor contenido de quercetina fue el único tratamiento que mostró una disminución de la fracción de agliconas y glucósidos. Es posible considerar esta práctica como método eficaz para reducir y estabilizar la quercetina. Entre los productos pertenecientes al grupo de las enzimas, algunas pectolíticas y α- y β-glicosidasas tuvieron un efecto hidrolizante sobre las concentraciones del glucósido de quercetina y especialmente del glucurónido, aumentando el contenido de la fracción aglicona.  Se confirmó la acción del PVPP y de los carbonos vegetales sobre la reducción de la aglicona, y uno de los carbonos, en particular, resultó ser más incisivo en la reducción completa de su concentración. A pesar de la gran eficacia de estos clarificantes, no hay que subestimar el efecto sustractivo desde el punto de vista organoléptico, ya que afecta al color, a la estructura y a los aromas y, por tanto, potencialmente a la calidad. Para conseguir la estabilización, hay que evaluar el contenido de las distintas formas de quercetina: en el caso de un alto contenido de formas combinadas, la adición de enzimas provoca su hidrólisis, favoreciendo la liberación de la aglicona. Sólo entonces será posible eliminar el exceso de fracción libre con los clarificantes adecuados y reducir su contenido por debajo de un umbral de riesgo.  Además de la fracción de aglicona y glucósido, el contenido de glucurónido de quercetina representa un riesgo potencial de inestabilidad, ya que durante la crianza y envejecimiento podría dar lugar a un aumento, aunque lento, de la aglicona y a la posterior precipitación debido a su hidrólisis.   

BIBLIOGRAFÍA

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Vintegro es un proyecto financiado en el marco de la Asociación Europea para la Innovación y el Plan de Desarrollo Rural de la Región de Toscana (medidas activadas 16.2, 1.1, 1.2, 1.3).
Socios del grupo operativo Vintegro: Antinori, Col d'Orcia, Avignonesi, ISVEA, Universidad de Florencia, Vinidea, CAICT.
Se ha ocupado de Integridad y estabilidad del vino toscano.
El proyecto Vintegro tiene como objetivo producción de vinos con el menor uso de prácticas enológicas aditivas y/o sustractivas, reduciendo el impacto medioambiental y económico, y pretende abordar el problema de la inestabilidad del vino y, en particular, el de la inestabilidad macromolecular. El grupo operativo ha trabajado en una prueba de predicción de la inestabilidad del vino, mediante un protocolo rápido y barato que puede aplicarse al vino en varias fases del proceso de producción.

Para más información: www.vintegro.eu

 

PSR Toscana

 

Publicado el 26/04/2022
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