Levaduras Fructofílicas: Consecuencias de la selección de cepas de levadura

Existen muchas causas que históricamente se han atribuido a las fermentaciones lentas o a las paradas de fermentación. Estas incluyen factores vitícolas y del viñedo (altos grados Brix de la cosecha, deficiencias nutricionales, degradación fúngica y residuos agrícolas, incluidos pesticidas, fungicidas y herbicidas), de gestión de la bodega (eleción de la cepas de levadura no adecuada, procedimientos de rehidratación incorrectos, temperaturas de fermentación no óptimos, clarificación excesiva del mosto y niveles de nitrógeno asimilable por la levadura no correctos [NFA]), de sustancias inhibidoras (etanol, ácido acético, ácidos grasos de cadena media y sulfitos) y factores físicos (pH y temperaturas extremas).

A medida que investigadores y productores de levaduras han ido avanzando en la comprensión de los mecanismos de fermentación, algunos de los problemas mencionados anteriormente se han ido resolviendo. Sin embargo, la menor influencia de los factores mencionados, ha visto el aumento en concomitancia de la influencia de un factor diferente y que actualmente representa la casusa predominante de las fermentaciones lentas y paradas: la proporción entre glucosa y fructosa.⁶ Hay evidencias que sugieren que en más del 90 por ciento de los casos, algunas incluso muestran una incidencia aún mayor de alrededor del 95 por ciento,⁴ cuando tienen lugar fermentaciones lentas o paradas, la relación glucosa:fructosa es inferior a 1,0.

Saccharomyces cerevisiae es en general una levadura glucófila, lo que significa que consume preferentemente glucosa en lugar de otros azúcares. Mucha gente cree que el uso de una cepa de Saccharomyces bayanus ayudará a evitar estos problemas, sin embargo, esto es incorrecto. Básicamente, la antigua taxonomía de las levaduras se basaba en su capacidad para aparearse. Cuando los genetistas comenzaron a encontrar múltiples piezas de secuencias de ADN que surgían del grupo Saccharomyces sensu-stricto, se dieron cuenta de que este no era el mejor método. Con la llegada de la secuenciación del ADN, se pudo utilizar una metodología más precisa. Esto ha demostrado que muchas especies/cepas de levadura son una mezcla de múltiples cepas con uno o dos progenitores dominantes.

Durante este proceso se evidenció que aquellas cepas que se usaban en la industria del vino y que comúnmente se denominaban “Bayanus” no eran en realidad Saccharomyces bayanus sino Saccharomyces cerevisiae y que procedían principalmente de la familia “Prise de Mousse”.^7,8,10 Algunos fabricantes y distribuidores de levadura todavía etiquetan estas levaduras como Saccharomyces bayanus, lo cual es incorrecto. El descubrimiento de algunas verdaderas cepas de Saccharomyces bayanus, aisladas en la Patagonia (a partir de procesos de fermentación sin inoculación) confirmó esta evidencia.⁵ Sin embargo, tras su secuenciación, estas han sido reclasificadas como Saccharomyces eubayanus. Las características que definen estas cepas son, en general, su tolerancia al frío y su carácter no fructofílico. En realidad, hasta ahora se han aislado muy pocas cepas de Saccharomyces bayanus, y aún menos cepas se encuentran disponibles comercialmente.

En la mayoría de los casos, durante las fermentaciones la glucosa se consume a un ritmo mayor que la fructosa (el otro azúcar predominante en las fermentaciones enológicas). Como consecuencia, la proporción de fructosa aumenta a medida que avanza la fermentación. Cuando al final de la fermentación la fructosa se convierte en el azúcar predominante, a menudo esto da lugar a fermentaciones lentas o paradas. Sin embargo, es importante reconocer que las cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae (las más utilizadas en las vinificaciones) consumen determinados azúcares a niveles diferentes. Algunas son glucófilas, otras fructófilas y entre medias hay una variabilidad continua. Para comprender por qué esto es importante, es necesario comprender la génesis de este problema, las consecuencias y cómo se puede abordar.

¿Por qué ocurre esto?

En parte, esto puede atribuirse a un aumento de los niveles de alcohol y al deseo de producir vinos más frutales. Como han señalado muchos críticos y consumidores, los vinos de mesa solían tener niveles de alcohol significativamente más bajos que los que tienen actualmente. Hoy en día es frecuente producir vinos con 14% - 14,5% ABV. Tampoco es raro ver vinos con más del 15% ABV. Pero ¿por qué ocurre esto? Dejando de lado los debate relacionados con el calentamiento global y sus implicaciones, hay que evidenciar dos razones fundamentales: la primera está relacionada con los imperativos comerciales y la segunda es vitícola.

En los últimos 30 años, algunos asesores/críticos de vinos han “empujado” los vinos tintos, en particular, hacia un cierto estilo caracterizado por unos niveles más altos de fruta madura y taninos más suaves (ignorando la influencia del roble). Este estilo de vino a menudo ha recibido puntuaciones más altas y elogios por parte de críticos influyentes, con el consiguiente aumento posterior de ventas. En parte como consecuencia de esto, la distinción entre azúcar y madurez fisiológica se ha vuelto cada vez más importante.

Normalmente, en zonas de clima más cálido la madurez fisiológica sigue a la madurez del azúcar. En términos generales, la madurez fisiológica se considera más perjudicial para la calidad del vino que la madurez del azúcar. Por este motivo, el concepto "tiempo de espera" ha ido cobrando cada vez mayor importancia, llevando a la madurez fisiológica e, implícitamente, a un estilo del vino que probablemente obtenga mayores elogios de la crítica. Para comprender completamente las implicaciones de todo esto, es importante echar una mirada atrás, hacia las bases de la Viticultura, en particular hacia las fases del crecimiento de la vid.

Tres Fases de Crecimiento de la Vid

Durante la fase uno, se determina el tamaño de las bayas, las bayas están verdes y la velocidad de respiración es rápida. La fotosíntesis es suficiente para satisfacer las demandas nutricionales de la baya. La concentración de ácido es alta y la concentración de azúcar es baja y constante. En esta fase, la proporción de glucosa y fructosa es superior a 1,0. Durante la fase dos, el ritmo de crecimiento de las bayas disminuye y los ácidos alcanzan sus niveles más altos. Los azúcares, especialmente la glucosa, comienzan a acumularse. Esta fase finaliza con el inicio del envero. La fase tres ve un aumento de la masa y volumen de las bayas. La relación glucosa:fructosa alcanza el equilibrio.⁷

Sin embargo, es importante señalar que cuanto más tiempo permanecen las uvas en la vid, más fructosa se acumula proporcionalmente. Si bien en realidad hay pocos datos relacionados con el cambio en la composición del azúcar durante estas fases de crecimiento (y los datos disponibles son de hace relativamente bastantes años), en los dos gráficos siguientes, 1 y 2, se pueden observar evidencias que respaldan este fenómeno.

Gráfico 1: Cambios en la relación glucosa:fructosa en Pinot Noir en la Costa Central (2013) antes de la vendimia.

Gráfico 2: Cambios en la relación glucosa:fructosa en Cabernet Sauvignon en la Costa Central (2013) antes de la cosecha 

Las consecuencias de este proceso y del "tiempo de espera" prolongado son muy evidentes, no solo desde el punto de vista de la calidad del vino, sino también de las posibles implicaciones: paradas de fermentación y fermentaciones lentas. Teniendo en cuenta que la fructosa es aproximadamente el doble de dulce que la glucosa, cualquier fructosa que no se consuma puede afectar negativamente a la calidad del vino debido a que los vinos pueden percibirse más dulces de lo que realmente son. Además, la fructosa residual también significa un menor rendimiento de etanol y un mayor riesgo de deterioro microbiano.¹ En parte, estas consecuencias se pueden mitigar un poco mediante el uso de cepas de levadura fructofílicas, es decir, cepas que tienen una mayor capacidad para consumir fructosa.

La capacidad de ciertas cepas de levadura para consumir preferentemente un determinado tipo de azúcar es algo que no es nuevo. En 1932, Edward Romer Dawson publicó un artículo: "La fermentación selectiva de glucosa y fructosa por la levadura". Sin embargo, llegó a dos conclusiones importantes: que la selectividad exhibida por cualquier levadura en particular no es constante y que depende de las condiciones de cultivo a las que ha estado sometida durante el crecimiento. Por lo tanto, es fácil comprender por qué investigadores como Linda Bisson (Universidad de California, Davis) e investigadores del AWRI han señalado que la alta concentración residual de fructosa puede ser un síntoma más que una causa de las paradas de fermentación o fermentaciones lentas. ^2,3 Pero ¿por qué ocurre?

El rendimiento de la levadura está determinado en parte por el genotipo o composición genética, que depende de la especie y la cepa. Las cepas de levaduras enológicas difieren a nivel de cinética fermentativa, requisitos de nitrógeno, tolerancia al etanol, tolerancia a la temperatura y también consumo de glucosa:fructosa (por nombrar solo algunas de las características que más las definen). Estas diferencias entre cepas son más pronunciadas en condiciones estresantes, lo que sugiere diferencias a nivel de adaptación al medio ambiente.⁶ Basándose en esto, los investigadores han descubierto que, con respecto al consumo de glucosa y fructosa, la suplementación con nitrógeno ayuda a estimular de forma importante la utilización de fructosa y que, en condiciones de alto contenido de etanol, la utilización de fructosa se inhibe más que la utilización de glucosa.¹ Por lo tanto, el uso de una cepa de levadura fructofílica por si sola no garantizará necesariamente una fermentación sin problemas. Ciertamente reducirá la probabilidad, pero de ninguna manera es la "panacea". 

Figura 1. (A) Representación de una célula de levadura donde se destacan las áreas clave de la célula que se ven afectadas por el etanol. (B) Representación esquemática de una membrana celular ampliada que ilustra la organización bicapa de los fosfolípidos y la integración de proteínas, algunas de las cuales actúan como vías de escape para el transporte de nutrientes. El etanol es soluble en las membranas celulares y tiene un impacto dramático en la integridad de su estructura. De hecho, se cree que la membrana es uno de los principales "objetivos" del etanol. (C) Esta figura ilustra el impacto del etanol en las membranas biológicas. los ácidos grasos de los lados opuestos de la bicapa de fosfolípidos se entrelazan y se cree que las proteínas se ven afectadas (se muestra a través del cambio de color, de amarillo a verde, entre las Figuras 1A y 1B); sin embargo, los efectos precisos del etanol sobre las proteínas de la membrana no se conocen con precisión. Ilustraciones de Dung Quoc Tran.

Para reducir aún más la probabilidad de una fermentación lenta o parada como consecuencia del desequilibrio en la relación glucosa:fructosa, se deben tener en cuenta las diferencias entre las variedades de uva (es más probable que haya problemas con Chardonnay que con Chenin Blanc, por ejemplo).^3,7 También hay que tener en cuenta la vendimia. En añadas cálidas y secas, generalmente hay una relación glucosa:fructosa más baja^.3 La selección de la cepa de levadura debe, en parte, basarse en la composición de los azúcares en el mosto. Se recomienda el uso de una cepa de levadura fructofílica cuando hay una mayor cantidad de fructosa que de glucosa, es decir, cuando la relación glucosa:fructosa es inferior a 1,0. Por último, probablemente lo más importante, cuando hay más fructosa que glucosa, es que hay que prestar mucha atención a otros factores de riesgo adicionales, como NFA insuficiente y alto potencial de alcohol final.

Los problemas de fermentación suelen surgir debido a la presencia y al impacto de más de un factor de estrés. Algunas investigaciones han demostrado que un NFA inicial alto podría estimular preferentemente el consumo de fructosa, lo que evidencia la importancia de realizar el análisis del nivel de NFA inicial. Algunos trabajos también han demostrado que cuando los niveles de NFA caen por debajo de 140 mg N/L en mosto blanco clarificado con un nivel moderado de azúcar, aumenta el riesgo de fermentaciones lentas o paradas. Sin embargo, a medida que aumenta la demanda de NFA a temperaturas de fermentación y concentraciones de azúcar más altas, este umbral también aumenta. Desafortunadamente, se requiere sucesivas investigaciones para determinar este umbral en el caso de las fermentaciones de vino tinto. ³

Por otro lado, también se ha observó que cuando se adicionaba nitrógeno al mosto, las cepas consumían entre un 6% y un 9% más de glucosa y entre un 13% y un 17% más de fructosa. Además, la suplementación con fosfato diamónico en una etapa tardía de la fermentación también mejoraba el consumo de fructosa.¹ Asimismo, los investigadores han notado que múltiples factores (algunos de los cuales son inevitables, por ejemplo, niveles crecientes de etanol) generalmente tienen un efecto sinérgico entre sí. ^3,6 No poder medir o evaluar estos factores causales en tiempo real acentúa aún más el problema.³ Esto sugiere que, si bien la capacidad de consumir preferentemente fructosa es importante, otros atributos de las cepas de levadura fructofílicas pueden ser igualmente importantes: demandas bajas de nitrógeno y tolerancia al alcohol, por ejemplo. En última instancia, lo que un enólogo puede controlar más fácilmente es la selección de la cepa de levadura que se utilizará en la fermentación, teniendo en cuenta no solo si es fructofílica sino también otros atributos de la cepa.

Mientras tanto, los fabricantes de levadura y los investigadores seguirán ayudando a lograr una mejor comprensión de la fisiología de los microorganismos del vino y del impacto de su entorno. Además, a través del cruzamiento selectivo, la hibridación, la evolución adaptativa y la investigación de otras especies de levadura que podrían ser más adecuadas para la fermentación de fructosa, será posible reducir los problemas relacionados con las fermentaciones lentas y paradas.

Conclusiones: 

• Cuando la proporción de glucosa:fructosa sea inferior a 1,0, los enólogos deberían considerar el uso de cepas de levaduras fructofílicas para garantizar una menor probabilidad de fermentaciones lentas o paradas. Todos los fabricantes y distribuidores de levaduras tienen cepas fructofílicas y sus técnicos comerciales podrán orientar a los enólogos en la dirección correcta
   
• Sin embargo, cuando la relación glucosa:fructosa es inferior a 1,0, el uso de una cepa de levadura fructofílica no garantizará necesariamente una fermentación segura siempre. Será fundamental una correcta gestión de la fermentación.
   
•  Se debe prestar atención a otros factores de riesgo, como la rehidratación adecuada de la levadura, el nivel de NFA, la temperatura de fermentación y el alcohol potencial final, para garantizar el éxito de la fermentación.
  
   

Información técnica sobre las levaduras fructofílicas: Fructo - Fructo select

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LEVADURAS Y NUTRICIÓN

entrevista a Jason Mabbett
Jason Mabbett es el responsable de las aplicaciones técnicas de AB Biotek. Antes de desempeñar este cargo que inició hace ya 10 años, fue el referente en América del Sur para después centrarse exclusivamente en América del Norte hace tres años. Antes de unirse a AB Biotek, Jason estudió viticultura y enología en la Universidad de Lincoln, Nueva Zelanda, y realizó varias vendimias en Argentina, Australia, Nueva Zelanda y Estados Unidos.

P: Hay muchos tipos diferentes de levadura. ¿Cómo saber cuál elegir?

La levadura debe seleccionarse en función de la variedad de uva y del estilo de vino que se quiere elaborar. Sin embargo, hay factores clave que es necesario considerar: La tolerancia al etanol de la cepa de levadura debe superar el grado alcohólico potencial previsto. Los requerimientos de nitrógeno deben coincidir con las condiciones nutricionales del mosto. Cuando el control de la temperatura de fermentación no es posible, es necesario considerar también la tolerancia a la temperatura. Si se desea la FML, es importante tener en cuenta la compatibilidad de la cepa de levadura con la fermentación maloláctica (FML).

La producción de compuestos aromáticos específicos es un factor que también hay que considerar, pero la capacidad de producir un determinado espectro de compuestos volátiles depende parcialmente de la composición del mosto. Los aromas producidos variarán dependiendo de los niveles de precursores presentes. La producción y cantidad de ésteres y tioles también se puede favorecer mediante el control de la evolución de la temperatura de fermentación; esto es más evidente y decisivo en uvas como la Sauvignon Blanc.

No existe una única elección "correcta" de la cepa de levadura. De hecho, para cada variedad de uva hay muchas opciones posibles que permiten hacer un buen vino. Sin embargo, es importante comprender los atributos de cada cepa de levadura para asegurar que se elige la que dará un perfil de fermentación óptimo y las características sensoriales deseadas.

P: ¿Es tan importante rehidratar la levadura?

Numerosas investigaciones muestran que la pared celular de la levadura es muy frágil durante los primeros minutos de la fase de rehidratación. Cuando una célula de levadura desecada se rehidrata, su pared celular se hincha y la membrana recupera su elasticidad. Si la rehidratación no se lleva a cabo correctamente, la célula puede filtrar importantes compuestos celulares a través de la membrana, que es extremadamente permeable en el momento de la rehidratación. Como consecuencia, la levadura perderá viabilidad y las poblaciones siguientes tendrán una menor capacidad de llevar a cabo la fermentación. Podría decirse que la información más importante que proporcionan los fabricantes de levadura son las instrucciones para la preparación correcta de la levadura de vino seca activa, que es esencial para un rendimiento óptimo.

P: ¿Se puede añadir demasiada o muy poca levadura? ¿Esto podría afectar al aroma/gusto?

La cantidad de inóculo influye en la fase de latencia (la velocidad de crecimiento inicial antes del crecimiento exponencial rápido) y en la velocidad de fermentación general, así como, potencialmente, en el sabor del vino acabado.

Un cantidad escasa de inóculo dará como resultado una fase de latencia más prolongada y un mayor riesgo de contaminación, ya que la cepa inoculada busca dominar a otras levaduras que puedan estar presentes (incluso después de las adiciones de SO₂). Si bien estas cepas pueden proporcionar aroma y complejidad a un vino, también pueden influir negativamente en su aroma. Por ejemplo, algunas cepas de Kloeckera apiculata pueden producir potencialmente hasta 25 veces la cantidad de ácido acético que normalmente produce S. cerevisiae. Además, estas cepas nativas también pueden dar lugar a tiempos de fermentación más prolongados o, en algunos casos, a paradas de fermentación, posiblemente debido a la producción de ácido acético, ácidos octanoico y decanoico, o a factores "killer".

Por el contrario, la adición de una cantidad excesiva de levadura puede acelerar la fermentación y puede provocar una autolisis prematura de la levadura (muerte de la levadura) y, por lo tanto, ceder al vino notas de panadería.

P: ¿Cómo influyen las diferentes fuentes de nitrógeno en el rendimiento de la fermentación de la levadura y/o en las características sensoriales?

El nitrógeno se presenta en dos formas: nitrógeno inorgánico, como las sales de amonio (DAP) que se adicionan durante la fermentación alcohólica, y nitrógeno orgánico, como pequeños péptidos y aminoácidos libres, que derivan de las levaduras adicionadas (inactivas o autolisadas) y del propio mosto de uva. Cuando las células de levadura se inactivan, parte de las proteínas celulares se hidrolizan y quedan disponibles como pequeños péptidos y aminoácidos que la levadura viva puede asimilar durante la fermentación. Los autolisados de levadura contienen más NFA que la levadura inactiva. La levadura saca mayores beneficios del uso de una mezcla de diferentes fuentes de nitrógeno; el uso de nitrógeno tanto orgánico como inorgánico es importante para un crecimiento y rendimiento óptimos.

La levadura consume más fácilmente la forma inorgánica del nitrógeno, y las células de la levadura pueden absorberlo fácilmente durante la fase de crecimiento e incluso cuando la concentración de alcohol aumenta durante la fermentación primaria. Los aminoácidos, por otro lado, requieren un mayor gasto de energía para ser llevados a la célula a través de las proteínas de transporte ubicadas en la membrana celular.

Los compuestos nitrogenados son necesarios para conseguir fermentaciones completas y sin olores anómalos. El nitrógeno fácilmente asimilable por la levadura (NFA) puede influir significativamente en la producción de algunos de metabolitos volátiles, especialmente los ésteres de acetato y de etilo, que como se sabe son positivos para el aroma del vino cuando están en equilibrio. Por ejemplo, en Chardonnay, el sabor y el estilo del vino se puede modular radicalmente mediante la concentración inicial de NFA del mosto. Recomendamos consultar el trabajo realizado por Bell y Hens : https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1755-0238.2005.tb00028.x

P: ¿Por qué algunos nutrientes de fermentación incluyen vitaminas y oligoelementos y cómo ayudan al rendimiento de la levadura?

P: ¿Cuándo se debe adicionar el nutriente?

La levadura metaboliza los nutrientes en diferentes momentos a lo largo de la fermentación. Añadir los nutrientes en el momento más adecuado puede mejorar el rendimiento de la levadura. A medida que avanza la fermentación y aumenta el nivel de etanol, la levadura se vuelve cada vez menos capaz de asimilar los nutrientes. El etanol inhibe los transportadores clave de la pared celular y si se adicionan los componentes después de la inhibición, los sustratos no se incorporarán a la célula.

El momento más eficaz para adicionar los nutrientes clave es una vez que la población de Saccharomyces se ha vuelto dominante, generalmente de 24 a 48 horas después de que se haya añadido el inóculo con la levadura rehidratada. En general, los fabricantes recomiendan adicionar nutrientes complejos a un tercio de la fermentación, es decir a un tercio del consumo de azúcar. Se puede adicionar levadura inactivada durante la fermentación para varios propósitos; las adiciones tempranas pueden ser beneficiosas para la desintoxicación del mosto con el fin de facilitar la actividad de la levadura rehidratada, y las adiciones tardías pueden contribuir a la sensación en boca del vino.

El objetivo es mantener la levadura saludable y vital, por lo que es preferible añadir nutrientes durante la fase exponencial antes de que la nutrición se vuelva limitante. Pocos nutrientes son tóxicos, pero si los nutrientes se adicionan demasiado pronto, podrían sedimentar o ser adsorbidos por el mosto junto con otro material orgánico.

P: ¿Puede ocurrir que se adicione demasiado nutriente? ¿Qué sucede si se añaden nutrientes en exceso?

La sobrenutrición de las fermentaciones puede ser tan problemática como la subnutrición, ya que es probable que las altas velocidades de fermentación provoquen un sobrecalentamiento de la fermentación y la pérdida de compuestos aromáticos volátiles. Añadir un exceso de nitrógeno puede provocar problemas microbiológicos, ya que se convierte en alimento para organismos contaminantes como Brettanomyces, Acetobacter y bacterias lácticas de los géneros Lactobacillus y Pediococcus.

P: ¿Se pueden añadir nutrientes de levadura para las bacterias (MLF)? ¿Por qué sí o por qué no?

Las bacterias malolácticas no pueden utilizar fuentes de nitrógeno inorgánico. Las bacterias no pueden almacenar ni sintetizar todos los aminoácidos esenciales, por lo que se deben utilizar nutrientes complejos.

El vino recién fermentado a menudo puede presentar deficiencias o carencias de nutrientes debido a que han sido utilizados por la levadura. El agotamiento de los nutrientes puede provocar fermentaciones malolácticas lentas o incluso paradas. Debido a los complejos requisitos nutricionales de las bacterias malolácticas y al medio relativamente poco afín para su crecimiento, es importante minimizar el estrés nutricional. Además de los aminoácidos y péptidos, que son las fuentes de nitrógeno más determinantes y necesarias para el crecimiento de las bacterias malolácticas, las vitaminas del complejo B y los minerales traza son especialmente importantes.

Figura 2: Análisis sensorial descriptivo de vinos Chardonnay elaborados mediante la fermentación con Saccharomyces cerevisiae AWRI 796 de un mosto con un contenido de 160 mg N/L (CUADRADO VERDE) o 320 (PUNTO ROJO) o 480 mg N/L (TRIÁNGULO AZUL) elaborado mediante adición de cloruro de amonio (Torrea y Henschke 2004), extraído de S-J. Bell y PA Henschke (2005) Australian Journal of Grape and Wine Research 11, 242-295; y reproducido aquí con permiso de la Sociedad Australiana de Viticultura y Enología

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