Los procesos para el aislamiento de cultivos puros de levadura y para su producción como levaduras secas activas han mejorado mucho desde 1965, cuando se introdujeron comercialmente por primera vez. Desde entonces, Saccharomyces cerevisiae se convirtió en la levadura preferida para la fermentación de mostos de uva. ¿Por qué adquirió tanta importancia?
Desde una perspectiva técnica, el hecho de que S. cerevisiae sea una levadura relativamente fácil de cultivar, pueda conservarse durante largos períodos en suspensión y tenga una genética accesible que pueda seguirse a lo largo del ciclo sexual y asexual es una gran ventaja. Esto ha facilitado su uso en la producción de alimentos y bebidas durante milenios.1 En el caso específico de la vinificación, se debe en gran medida a la capacidad natural de S. cerevisiae de dominar la fermentación y a sus interesantes propiedades organolépticas.7 Esto ha permitido un mayor control de las vinificaciones, resultados más predecibles y una disminución del riesgo de contaminación por otros microorganismos.
Sin embargo, no contentos con las cepas de S. cerevisiae obtenidas a partir de fermentaciones naturales o espontáneas, los investigadores y fabricantes de levaduras han recurrido a métodos no modificados genéticamente para modular el rendimiento de la fermentación, el aroma y el sabor. Mediante el uso de retrocruzamiento para la eliminación de genes específicos, rare mating, aislamiento de cepas de levadura y mutagénesis los investigadores han podido proporcionar a los enólogos nuevas herramientas adicionales para abordar las necesidades de los consumidores. Por ejemplo, la posibilidad de inhibir el desarrollo de sulfuro de hidrógeno en la levadura ha permitido elaborar vinos más limpios y aromáticos. Los avances en la investigación centrada en la genética y la biología molecular han tenido implicaciones para la ciencia del vino y la vinificación al incrementar las opciones de levadura a disposición.
Si bien también hemos visto la llegada de levaduras enológicas modificadas genéticamente (OGM), los sentimientos predominantes contra los OGM tanto por parte de los consumidores como de otras autoridades reguladoras a nivel mundial han minimizado la generalización de su uso comercial, a pesar de que presentan algunos atributos atractivos. En muchos aspectos, es gracias a este contexto de mayor innovación y capacidades tecnológicas (especialmente desde el punto de vista de la fabricación), así como la reticencia a utilizar OGM, que tanto enólogos como investigadores han reconsiderado el papel de las cepas de levadura no tradicionales como un camino para futuros desarrollos e investigaciones.
Estas cepas de levadura, en particular las no Saccharomyces, son significativamente diferentes en sus atributos de las utilizadas históricamente en la industria del vino. Solo ahora, gracias a la mayor innovación y capacidad tecnológica, se encuentran más fácilmente disponibles como nuevas herramientas para los enólogos. Pero, ¿por qué existe este interés por las cepas no Saccharomyces y cuáles son las razones de ello? Para responder a esta pregunta, es necesario entender qué son realmente estas cepas no Saccharomyces y cuáles son sus atributos.
Cepas de levadura no Saccharomyces
Levadura no Saccharomyces es un término coloquial utilizado en la industria del vino y utilizado como término general para incluir muchas especies de levaduras diferentes. En términos generales, estas especies de levaduras están presentes en las uvas, en los equipos y/o en el ambiente de la bodega (ya sea por su presencia en el aire o a través de insectos). Estos incluyen, por ejemplo, Torulaspora, Metschnikowia, Pichia, Brettanomyces, Klockera, Lachancea thermotolerans y Candida. Este grupo de levaduras se puede dividir en tres subgrupos: aeróbicas, apiculadas y aquellas con metabolismo fermentativo. Dado que las levaduras apiculadas se asocian a la producción de acidez volátil (en detrimento de la calidad del vino),8 la investigación sobre la utilidad de estas especies se ha limitado en gran medida al primer y tercer grupo. ¿Por qué estas especies son de particular interés?
Las recientes prácticas de producción de vino: el uso de cepas S. cerevisiae con gran potencia fermentativa, las adiciones de anhídrido sulfuroso antes y después de la vendimia y una mejor higiene de la bodega han minimizado la influencia de las cepas no Saccharomyces que ya están en el mosto y/o la bodega. El miedo al riesgo de posibles factores de contaminación ha superado el interés por las potenciales contribuciones positivas ofrecidas por las levaduras no Saccharomyces.
Sin embargo, numerosos trabajos de investigación han demostrado que los beneficios de Torulaspora delbrueckii, Lachancea thermotolerans, Pichia kluyveri, Schizosaccharomyces pombe y Metschnikowia pulcherrima pueden tener un impacto positivo en la calidad del vino acabado.11 Más que proporcionar una descripción general de todas estas cepas, vamos a centrarnos sobre todo en una de las mencionadas anteriormente, Metschnikowia pulcherrima, que está siendo objeto de gran interés entre los investigadores por determinadas propiedades muy ventajosas para la vinificación, en particular el biocontrol, la calidad del vino acabado y la posible reducción del grado alcohólico.
Metschnikowia pulcherrima se conoce por ser una levadura ubicua.5 Se puede encontrar en uvas, cerezas, flores, frutas en mal estado y en insectos que se alimentan de frutas. Cada vez más, los fabricantes y distribuidores están facilitando una disponibilidad cada vez mayor de Metschnikowia a nivel comercial.
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Las células de Metschnikowia pulcherrima presentan una forma más alargada de tipo limón (izquierda) respecto a las células Saccharomyces cerevisiae (derecha), cuya morfología circular es más parecida a la tradicional forma de las levaduras.
Biocontrol
El uso frecuente de anhídrido sulfuroso como agente antimicrobiano en bodegas se debe a su bajo costo y gran eficacia. Sin embargo, existe una tendencia creciente a reducir su uso debido a las reacciones alérgicas de algunos consumidores frente a este compuesto, así como por razones medioambientales y estilísticas. Gracias a su capacidad para producir compuestos antimicrobianos, Metschnikowia pulcherrima puede usarse como agente natural para el control biológico, pudiendo reemplazar parcial o totalmente el anhídrido sulfuroso (dependiendo de la calidad de las uvas recibidas en la bodega).
En particular, las colonias de Metschnikowia pulcherrima secretan ácido pulcherrímico (el precursor del pigmento pulcherrimina) que agota el hierro presente en el mosto, lo que hace que no esté disponible para otras especies de levaduras y de esta forma se inhibe su crecimiento.6 Esto impide contaminaciones por levaduras silvestres no deseadas, como Brettanomyces/Dekkera, Hanseniaspora y algunas cepas de Pichia (por ejemplo, Pichia anomala), y evita depender del uso de SO2.
Por otro lado, también se ha sugerido que, si bien el agotamiento del hierro es un mecanismo inhibidor importante, hay otros atributos que también pueden participar en esta actividad antimicrobiana, como por ejemplo la competición por los nutrientes. Se ha observado que ciertas cepas de Metschnikowia pulcherrima afectan negativamente al crecimiento de otros microorganismos al consumir nutrientes más rápido que aquellos con los que compiten.5
Además, es muy posible que la secreción de enzimas por parte de Metschnikowia pulcherrima, como la quitinasa y la glucanasa, también afecte a las células de otros microorganismos.9 A pesar de que este aspecto requiere seguramente sucesivas investigaciones, lo que sí está claro es que Metschnikowia pulcherrima presenta actividad antimicrobiana y, por lo tanto, representa una potencial herramienta en vinos donde se necesita no incluir el anhídrido sulfuroso como aditivo en la etiqueta del vino.
Efectos sobre el aroma/calidad del vino
En general, S. cerevisiae no es un buen productor de enzimas exógenas. Las cepas no Sacharromyces, sin embargo, presentan atributos interesantes con respecto a esto. En particular, Metschnikowia pulcherrima tiene las siguientes actividades enzimáticas: ß-glucosidasa, proteasa, glucanasa, liquenasa, celulasa, xilaniasa, sulfito reductasa, liposa y ß-liasa.5 Varias de estas actividades son particularmente útiles para la vinificación. Ricardo Vejarano resume algunos de estos beneficios:12
Beneficios de las enzimas
ß-glucosidasa
- Liberación de terpenos a partir de sus precursores glicosilados,,
- Liberación de tioles a partir de sus precursores cisteinilados.
Proteasa
- Mejora de la extracción y clarificación del mosto y de la filtración y estabilización del vino,
- Mejora de la estabilidad de la espuma en vinos espumosos,
- Aumento del contenido de aminoácidos, producción de compuestos aromáticos.
ß-liasa
- Liberación de tioles de sus precursores no aromáticos combinados con carbono-azufre.
Hay que señalar que la intensidad de la actividad enzimática no sólo depende de la especie sino también de la cepa.
Aparte de estos efectos enzimáticos sobre el aroma y sabor del vino, en un trabajo recientemente publicado realizado por Varela et al (2021) se demostró que los vinos Shiraz y Cabernet Sauvignon producidos con preparaciones de levadura seca activa de Metschnikowia pulcherrima mostraron una mayor intensidad de algunos atributos deseables ("fruta roja" aroma y sabor a 'fruta negra') y bajas puntuaciones de los descriptores negativos (aroma vegetal y atributos sensoriales de reducción). El análisis de la composición volátil y el posterior análisis sensorial de los vinos elaborados con Metschnikowia pulcherrima muestra que estas preparaciones de levaduras pueden ayudar a moldear positivamente tanto el perfil sensorial como el estilo del vino.11
Reducción del etanol
El aumento de los niveles de alcohol en el vino ha hecho que los vinos con 14% ABV e incluso superiores sean cada vez más frecuentes. Sin embargo, debido a consideraciones de salud, imperativos financieros (impuestos) y demandas de los consumidores, ha habido un gran impulso hacia la reducción de los niveles de alcohol evitando afectar a la calidad y el aroma y sabor del vino. A este respecto, un aspecto común a todas las cepas de Metschnikowia pulcherrima, es su carácter Crabtree negativo, lo que ofrece la oportunidad de usar esta especie para consumir los azúcares de manera no convencional con el fin de reducir el contenido de etanol en los vinos.
Las levaduras no Saccharomyces han mostrado la capacidad potencial de producir menos etanol en el vino2, 10. Esto es en gran medida consecuencia de los mecanismos de absorción de nutrientes y de los implicados en la regulación del metabolismo respiro-fermentativo. Generalmente, estas especies no Saccharomyces metabolizan el azúcar sin generar etanol o lo hacen con menor eficiencia.3
Por ello se han realizado numerosos estudios con la finalidad de encontrar cepas no Saccharomyces que sean capaces de reducir la graduación alcohólica del vino aprovechando esta diferencia a nivel de metabolismo respiratorio. Uno de los principales candidatos identificados hasta ahora es Metschnikowia pulcherrima. En un estudio realizado por Ángela Contreras et al, Metschnikowia pulcherima utilizada en inoculaciones secuenciales junto con S. cerevisiae produjo rendimientos de etanol significativamente más bajos en vinos Chardonnay y Shiraz.2 Si bien hubo un aumento concomitante de producción de glicerol y de algunos ácidos orgánicos, estos aumentos no fueron suficientes para explicar completamente la disminución del etanol. Desafortunadamente, los resultados obtenidos en este estudio, hasta la fecha, no ha sido posible reproducirlos a nivel comercial. En parte, esto fue debido a la imposibilidad de replicar a mayor escala los ensayos que se hicieron en laboratorio.
En un estudio de 2015, Pilar Morales et al demostraron que, en ensayos de laboratorio, eran posibles reducciones de hasta un 3,7 % (v/v).4 Estos resultados fueron significativamente superiores a los resultados de Angela Contreras et al, que lograron solo hasta un 1,6 % de reducción2. En ambos casos los autores evidenciaron dificultades en la reproducibilidad de los resultados. En el caso de Ángela Contreras et al. esto se atribuyó al hecho de que, si bien Metschnikowia pulcherrima reduce potencialmente los niveles de etanol, esta característica no está presente en todos los miembros de la especie Metschnikowia pulcherrima.
Dificultades/ Desafíos
Las cepas no Saccharomyces pueden convertirse en herramientas muy valiosas para los enólogos. En muchos casos, las fermentaciones espontáneas pueden no tener suficiente microflora para superar activamente a la cepa de levadura residente dominante al comienzo de la fermentación. La posibilidad de inocular un cultivo comercial seguro de cepas no Saccharomyces puede ser una herramienta muy valiosa para los enólogos, tanto en términos de complejidad como de otros atributos que poseen estas cepas.
Lachancea thermotolerans, por ejemplo, muestra una alta producción de ácido láctico capaz de influir significativamente sobre el pH del vino, a veces incluso reduciendo el pH en 0,5 unidades o más durante la fermentación. En el caso de Metschnikowia pulcherrima, esto significa poder actuar como agente de biocontrol, contribuir positivamente al perfil organoléptico del vino acabado o incluso actuar como método para reducir el nivel de alcohol. Otras especies también llevan consigo atributos específicos que podrían ser útiles.
Además del bajo poder fermentativo de Metschnikowia pulcherrima (generalmente se utiliza en inoculación secuencial junto con S. cerevisiae con el fin de completar la fermentación hasta el agotamiento de los azúcares), Pilar Morales et al. evidenciaron las dificultades para pasar de escala de laboratorio a escala comercial.4 Se necesitan nuevas investigaciones sobre selección de cepas y, a continuación, sobre estrategias de inoculación, cepas de levadura a utilizar para la inoculación secuencial con el fin de garantizar el agotamiento de los azucares, y sobre dispositivos y desarrollo de nutrientes de fermentación específicos.2
Estas interesantes levaduras no Saccharomyces estarán cada vez más disponibles en comercio, en un futuro cercano, a medida que los investigadores vayan comprendiendo más en profundidad sus capacidades y que los fabricantes de levaduras puedan comercializarlas. Sin duda, se convertirán en una herramienta muy importante para que la industria del vino avance.
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www.maurivin.com/yeast-strains (Gama Next Generation)
Metschnikowia pulcherrima
Referencias
1. Chambers, P. and S. Pretorius. 2010 Fermenting knowledge: The history of winemaking, science and yeast research. EMBO Reports, 11, 914 – 920.
2. Contreras, A. et al. 2014 Evaluation of non-Saccharomyces yeasts for the reduction of alcohol content in wine, Applied Environmental Microbiology, 80, 1670 – 1678.
3. Gonzalez, R. et al. 2013 Yeast respiration of sugars by non-Saccharomyces yeast species: A promising and barely explored approach to lowering alcohol content of wines. Trends in Food Science & Technology, 29, 1, 55-61.
4. Morales, P. et al. 2015 The impact of oxygen on the final alcohol content of wine fermented by a mixed starter culture. Applied Microbiol Biotechnology, 99, 3993–4003.
5. Morata, A. et al. 2019 Applications of Metschnikowia pulcherrima in wine biotechnology, Fermentation, 5, 63.
6. Oro, L. 2014 Antimicrobial activity of Metschnikowia pulcherrima on wine yeasts, J. of Applied Microbiology 116, 1209—1217.
7. Rankine, B. 1968 The importance of yeasts in determining the quality and composition of wines, Vitis 7, 22 - 49.
8. Romano, P. et al., 1992 Higher alcohol and acetic acid production by apiculate wine yeasts, J. of Applied Bacteriology, 73 (2), 126 – 130.
9. Sipiczki, M. 2020 Metschnikowia pulcherrima and Related Pulcherrimin-Producing Yeasts: Fuzzy Species Boundaries and Complex Antimicrobial Antagonism, Microorganisms 8 (7), 1029.
10. Varela, C. et al. 2017 Sensory profile and volatile aroma composition of reduced alcohol Merlot wines fermented with Metschnikowia pulcherrima and Saccharomyces uvarum. Intrnl J. of Food Microbiology, 252, 1 – 9.
11. Varela, C . et al. 2021 Volatile aroma composition and sensory profile of Shiraz and Cabernet Sauvignon wines produced with novel Metschnikowia pulcherrima yeast starter cultures, Australian Journal of Grape and Wine Research 27 (2), 1 - 13
12. Vejarano, R. 2020 Non-Saccharomyces in winemaking: Source of mannoproteins, nitrogen, enzymes and antimicrobial compounds, Fermentation, 6, 76.
