Determinación de levaduras viables con colorante de unión de ADN y PCR cuantitativa

La determinación y cuantificación de levaduras puede dar lugar a resultados engañosos debido a la sobre o subestimación de estos microorganismos. La subestimación puede ser causada por las diferentes velocidades de crecimiento de los diversos microorganismos en medio de cultivo o por la presencia de microorganismos viables pero no cultivables. La sobreestimación puede ser debida a la imposibilidad de discriminar los microorganismos vivos de los muertos si se usa la PCR cuantitativa para cuantificar usando ADN como molde. Sin embargo, se han descrito métodos de cultivo independientes que utilizan colorantes para eliminar ADN de células muertas y a continuación cuantificar los microorganismos vivos. En este trabajo se estudiaron dos colorantes: bromuro de etidio monoazide (EMA) y bromuro de propidio monoazide (PMA). La técnica se aplicó durante la fermentación de mostos y la crianza de vinos. Los dos colorantes dieron lugar a resultados parecidos durante el seguimiento de las levaduras. Cuando se utilizaron medios de cultivo con etanol fue necesario la recuperación de la membrana celular. Cuando se aplicó al mosto en fermentación, se observaron diferencias de hasta 1 unidad logarítmica entre los valores de QPCR con o sin colorante durante la fase estacionaria . En los vinos con crianza, se obtuvo una buena concordancia entre el método de recuento en placas y la QPCR. La mayoría de las células viables eran también cultivables y no se observaron diferencias entre los métodos, excepto en el caso de Zygosaccharomyces bailii y Dekkera bruxellensis para los que a veces se obtuvo una conteo superior con QPCR. La presencia de un exceso de células muertas no interfirió con la cuantificación de las células vivas con ninguno de los dos colorantes. Se aconseja la lectura del artículo completo