Determinación de levaduras viables mediante marcado de ADN con colorantes y PCR cuantitativa

La detección y cuantificación de las levaduras vínicas puede llevar a errores debido a la sub o sobreestimación de estos microorganismos. La subestimación puede ser causada por las diferentes velocidades de crecimiento de los diversos microorganismos en el medio de cultivo o por la presencia de microorganismos viables pero no cultivables. La sobreestimación puede ser provocada por la imposibilidad de discriminar entre microorganismos vivos y muertos si se utiliza la PCR cuantitativa para cuantificar ADN como ADN molde. Sin embargo, se han descrito métodos de cultivos independientes que utilizan colorantes para eliminar el ADN de células muertas y cuantificar a continuación los microorganismos vivos. En este trabajo se estudiaron dos colorantes: bromuro de etidio monoácido (EMA) y bromuro de propidio monoácido (PMA). La técnica se aplicó en fermentaciones de mostos de uva y en vinos envejecidos. Los dos colorantes dieron lugar a resultados parecidos durante el seguimiento de las levaduras. Cuando las levaduras procedían de medios que contenían etanol fue necesario recuperar la membrana celular. Cuando se aplicó sobre fermentaciones de mostos, se observaron diferencias de hasta 1 unidad log entre la estimación QPCR con o sin colorante durante la fase estacionaria. En vinos envejecidos, se observó una buena concordancia entre las técnicas de siembra en placa y QPCR. La mayor parte de las células viables también eran cultivables y no se observó ninguna diferencia entre los métodos, excepto para Zygosaccharomyces bailii y Dekkera bruxellensis para los que en algunos casos se obtuvo un conteo mucho mayor por QPCR. La presencia de un número elevado de células muertas no interfirió con la cuantificación de las células vivas, independientemente del colorante utilizado. Se recomienda la lectura del texto completo: “ Determination of viable wine yeast using DNA binding dyes and quantitative PCR.