1Fondazione Edmund Mach − Technology Transfer Center, via Edmund Mach 1, San Michele all’Adige 38050. Italy.
2Department of Agricultural, Food, Environmental and Animal Sciences, University of Udine, Via Sondrio 2/A, 33100, Udine, Italy.
tomas.roman@fmach.it
Artículo extraído de la presentación de Tomás Román con ocasión de Enoforum Web (5-7 de mayo de 2020)
Introducción
Los ultrasonidos (US) son ondas de naturaleza mecánica que se propagan en un medio elástico y líquido y que tienen la particularidad de provocar no solo una variación de presión, sino también de aportar energía al medio de propagación. Las ondas generan ciclos de compresión y rarefacción que llevan a la creación de burbujas de vapor o gas disuelto en el fluido -fenómeno conocido como cavitación- que una vez que alcanzan las dimensiones críticas, colapsan. Estas características son ampliamente explotadas en el campo de las tecnologías del procesado de alimentos tanto por sus efectos mecánicos como químicos, resultantes de la formación de radicales libres dentro de las burbujas de cavitación. La importancia de los dos efectos varía, sin embargo, en función de la frecuencia utilizada y, a los valores más bajos (20-100 kHz) propios de los ultrasonidos de potencia, predomina el mecánico debido a la cavitación de tipo inestable; cuanto más cerca de 20 kHz, mayor será la violencia con la que las burbujas colapsan. La producción de radicales a bajas frecuencias puede ser relevante y es causada por la sonólisis de moléculas y por la destrucción de la estructura del solvente y del soluto.
La tecnología de ultrasonidos, frente a numerosas aplicaciones en la producción de alimentos y bebidas, aún no se ha introducido significativamente en el sector del vino, si bien existan diferentes estudios de laboratorio que evalúan sus efectos durante algunas etapas de la vinificación. Han sido reportadas aplicaciones interesantes en la optimización de las fases fermentativas y postfermentativas, tales como el efecto en la lisis de las lías de fermentación (Cacciola et al ., 2013; Del Fresno et al., 2018 y 2019), en el envejecimiento acelerado del vino (García Martín y Sun, 2013; Ferraretto y Celotti, 2016) o sobre la extracción de compuestos presentes en las pieles de las uvas tintas (Celotti y Ferraretto 2016; El Darra et al., 2013; Ferraretto et al., 2013; Morata et al., 2017). Estudios recientes parecen también destacar el efecto positivo del tratamiento con ultrasonidos en las reacciones de polimerización de los taninos en vinos tintos, probablemente debido a la acción de los radicales libres generados (Ferraretto y Celotti, 2016). Todos estos hallazgos han llevado recientemente a la OIV a incluir la tecnología de ultrasonidos entre las prácticas permitidas en el tratamiento de uvas estrujadas para la extracción de compuestos de las pieles (Resolución OIV -OENO 616-2019).
Tras los resultados positivos obtenidos en la extracción de compuestos en uvas tintas y las experiencias preliminares en blancas (Celotti y Ferraretto, 2016), se ha querido investigar la posibilidad de sustituir la maceración prefermentativa de uvas blancas aromáticas por un breve tratamiento con ultrasonidos. Esta técnica permitiría por un lado reducir los posibles riesgos asociados a la maceración, como el desarrollo de microorganismos perjudiciales para la calidad del vino, y por otro, optimizar los recursos de la bodega en términos de frigorías y volumen a disposición durante la cosecha (en tanque o en prensa). La investigación que se presenta es el resultado de un enfoque empírico iniciado con un prototipo industrial utilizado para el tratamiento de las uvas. Los resultados sensoriales positivos han estimulado a investigar a escala de laboratorio la capacidad extractiva de ultrasonidos e indagar su efecto sobre las moléculas precursoras de los tioles varietales.
Materiales y métodos
Pruebas de bodega con prototipo industrial.
Las experiencias se llevaron a cabo con la Sauvignon Blanc en dos bodegas pertenecientes respectivamente a las denominaciones de origen Collio (Friuli Venezia Giulia/Italia) y Penedès (Cataluña/España). El prototipo industrial utilizado para la sonicación (Padovan, Vittorio Veneto, TV, Italia) operó en modo continuo sobre las uvas estrujadas. La alimentación de entrada del prototipo se realizó de forma continua a la salida de la despalilladorora utilizando una válvula «Y» que permitió alimentar de manera homogénea al sistema de ultrasonido y al testigo de maceración, asegurando la comparabilidad de las pruebas. El sistema de ultrasonidos operó a la frecuencia de 27 kHz con un tiempo de tratamiento de 2 min y amplitud del 90%. La muestra sonicada (US) fue directamente enviada a la prensa neumática, mientras que el control no sonicado (Test) fue sometido a 8 horas de maceración prefermentativa a 15 ° C en tanque refrigerado. En ambos, se mantuvieron los mismos protocolos y condiciones de vinificación hasta la evaluación sensorial de los vinos.
Efectividad extractiva del ultrasonido
Cinco muestras de Sauvignon Blanc y cinco Gewürztraminer fueron despalilladas manualmente con el pedicelo para asegurar la integridad de la baya y limitar la formación de precursores. Después de la homogeneización, se prensaron manualmente tres réplicas por cada muestra y se sonicaron durante 3 y 5 minutos (Sonoplus HD 2200, Bandelin electronic, Berlín, Alemania) a una frecuencia de 20 kHz, amplitud de 153 µm y con una potencia nominal total de 200 W. Las condiciones de tratamiento se establecieron en base a trabajos previos realizados en condiciones de bodega (Celotti y Ferraretto, 2016).
Interacción entre los ultrasonidos y los precursores tiólcos en solución modelo
La interacción entre los ultrasonidos y los precursores tiólicos se estudió en solución modelo de agua con cloruro de potasio (3 g/L) y ácido tartárico (6 g/L), ajustada a pH 3.0 y 3.5 con hidróxido de sodio. Las soluciones fueron luego añadidas con los precursores tiólicos: glutatión 3-mercaptoesan-1-ol (GSH-3MH; 140 µg/L), cisteína 3-mercaptohexan-1-ol (Cys-3MH; 30 µg/L), glutatión 4-mercapto-4-metil pentan-2-ona (GSH-4MMP; 60 µg/L) y cisteína 4-mercapto-4-metil pentan2-ona (Cys-4MMP; 83 µg/L). Cinco muestras de la solución se sometieron a un tratamiento de sonicación de 5 minutos en las mismas condiciones que el experimento del mosto (20 kHz; 153 µm; 200 W). Otras 5 alícuotas se calentaron en un baño termostático hasta alcanzar una temperatura máxima comparable a la del mosto tratado en un tiempo equiparable.
Análisis sensorial
La evaluación organoléptica de preferencia fue realizada por un panel de 11 enólogos expertos en la producción de Sauvignon Blanc, a quienes se les pidió que expresaran su preferencia en términos de calidad global de los vinos. Una segunda prueba sensorial fue realizada por un grupo de 30 expertos que evaluaron la intensidad de los descriptores del color, olor y gusto de las muestras en una escala de 1 a 9.
Métodos analíticos y estadísticos
Los parámetros de control de calidad se analizaron mediante espectrometría infrarroja en transformada de Fourier, calibrada con los métodos oficiales de la OIV. Los fenoles totales, los ácidos hidroxicinamilartáricos, las catequinas y los taninos condensados se cuantificaron de acuerdo con los métodos propuestos por Singleton et al. (1999), Ribéreau-Gayon (1970), Zironi et al. (1992); y Bate- Smith (1954) respectivamente.
La determinación de los precursores tiólicos en los mostos y en la solución modelo se realizó en LC-MS/MS aplicando el método propuesto por Larcher et al. (2013). La cuantificación de los compuestos libres se realizó después de derivatización en GC-MS/MS según las condiciones de análisis propuestas por Larcher et al.(2015).
El procesamiento de los resultados se llevó a cabo con el software Satistica 13.0 (Statsoft Inc, Tusla, EE. UU.). La evaluación de las diferencias sensoriales y químicas se realizó mediante análisis univariado de varianza (ANOVA) aplicando el método LSD de Fischer para la definición de grupos homogéneos (p<0.05). En las figuras, letras diferentes indican resultados estadísticamente diferenciados.
Resultados y discusión
Pruebas de bodega con prototipo industrial.
La división del estrujado con la válvula «Y» hizo posible garantizar la comparabilidad de las pruebas. En éstas, el tratamiento con ultrasonidos en ausencia de maceración (US) fue la única variable introducida con respecto al control, al que se aplicó una maceración prefermentativa según los protocolos productivos propios de cada bodega para la vinificación de la Sauvignon Blanc. El resto de las condiciones de vinificación, incluido el prensado, se mantuvieron inalteradas en la medida de lo posible vista la escala industrial. Los resultados medios de la evaluación sensorial se muestran en la figura 1A, realizada aproximadamente 6 meses después de la fermentación. No se observaron diferencias significativas (p <0,05) para ninguno de los descriptores, con la excepción de la intensidad del color del vino producido en el Penedès, probablemente debido a la mayor extracción de compuestos fenólicos en la maceración tradicional. La ausencia de diferencias entre los parámetros gustativos y olfativos de ambas pruebas confirma sensorialmente que el tratamiento con ultrasonidos puede reemplazar la maceración prefermentativa tradicional de uvas blancas aromáticas. La inevitable extracción de polifenoles asociada con ambas técnicas será manejable durante la vinificación con intervenciones de estabilización apropiadas de acuerdo con la cantidad extraída y con el objetivo enológico. En la valoración de la preferencia (fig 1B), si bien limitada a un juicio global, los catadores mostraron la ausencia de diferencias entre los dos protocolos de elaboración en los vinos producidos en el Penedès, mientras que en los del Collio, aproximadamente el 70% de los degustadores prefirió la muestra tratada con ultrasonidos y otro 10% no mostró preferencia entre ambos tratamientos.
El contenido de tioles totales – expresados como glutatión (GSH) – fue cuantificado al final de la crianza, mostrando valores prácticamente idénticos en los vinos producidos en el Penedès (37 y 38 mg/L para TEST y US respectivamente). En el caso de los vinos del Collio, en cambio, la concentración de tioles totales en el vino sonicado resultó mayor (100 mg/L) respecto al control obtenido por maceración tradicional (60 mg/L). Este parámetro analítico tiene en consideración todos los compuestos que contienen una función tiólica, entre los cuales el más importante es el glutatión; sin embargo, no permite aislar el efecto de los tioles varietales, moléculas conocidas por caracterizar la tipicidad de Sauvignon Blanc (Lund et al., 2009) y que están presentes en las uvas bajo forma de precursores no volátiles.
Como consecuencia de estos resultados, se decidió investigar el efecto de la tecnología de ultrasonidos en la capacidad de extracción de los precursores tiólicos de las uvas.
Efectividad extractiva del ultrasonido
El efecto extractivo de los ultrasonidos se verificó en dos variedades -Sauvignon Blanc y Gewürztraminer- conocidas por el impacto positivo de los tioles sobre su aroma y la tipicidad de sus vinos (Lund et al., 2009; Roman et al., 2018). En cada muestra se analizaron algunos parámetros de la fracción fenólica (catequinas, polifenoles totales, ácidos hidroxicinamiltartáricos, taninos totales) y la conductividad, utilizados como indicadores extractivos de la efectividad del tratamiento. Los resultados (fig. 2) muestran en ambas variedades una tendencia creciente en función del tiempo de tratamiento de los valores medios de los indicadores fenólicos y minerales, con diferencias significativas entre tratamientos (p <0.05) en todos ellos, excepto para los taninos.
La concentración media de precursores tiólicos se muestra en la figura 3. En relación a la Gewürztraminer, ninguna de las muestras reportó valores de los precursores de la 4MMP superiores al límite analítico de cuantificación, como cabía esperar en la Gewürztraminer del Trentino (Nicolini et al., 2020). El precursor cisteinilado del 3MH presentó una tendencia creciente con el tiempo de aplicación, en consonancia con los resultados obtenidos para la fracción fenólica, y con valores medios diferenciados después de 5 minutos de tratamiento. Inesperadamente, esta tendencia no se encontró en el precursor glutationilado (GSH-3MH), cuya concentración media permaneció casi inalterada, de manera similar a cuanto observado para Cys-3MH en la Sauvignon Blanc. La ausencia de diferencias desde un punto de vista estadístico también se repite para el resto de los precursores cuantificados en esta última variedad, sin embargo, con un trend medio decreciente en el conjunto de los datos y en cada uno de los lotes de Sauvignon Blanc.
El efecto discordante del tratamiento entre la concentración de los indicadores extractivos y de los precursores sugiere la existencia de una interacción con los compuestos sulfurados, posiblemente a través de la formación de radicales libres. La hipótesis – ya demostrada para otros tioéteres en otras matrices y condiciones experimentales (Wu et al., 2005) – se ve reforzada por dos factores: el primero es por el pH menor de las muestras de Sauvignon Blanc (media: 3.00; min: 2.92; max: 3.09) en comparación a las de Gewürztraminer (media: 3.52 ; min: 3.39; max: 3,62); esta diferencia favorecería la formación de radicales libres en Sauvignon Blanc durante la sonicación de los mostos. Los resultados muestran posiblemente la suma de los efectos extractivos y degradativos, siendo estos últimos menores en las pruebas realizadas con Gewürztraminer, en las cuales el pH era más alto. El segundo factor es la disminución en la concentración en el mosto de glutatión en la forma oxidada (GSSG) en función del tiempo de sonicación. Disminución que va acompañada de valores casi idénticos del compuesto en forma reducida (datos no mostrados). Ambas consideraciones reforzarían la hipótesis de la existencia de interacción entre los ultrasonidos y las moléculas que contienen un enlace -S- durante la sonicación.
Interacción entre los ultrasonidos y precursores tiólicos en solución modelo
Para verificar la posible interacción en el mosto entre los ultrasonidos y los precursores tiólicos se realizaron pruebas en solución modelo enriquecida con precursores de 3MH y 4MMP, ajustando el pH a valores similares a los de las uvas de la prueba anterior (3.0 y 3.5) y tratadas con ultrasonidos durante 5 min a las mismas condiciones operativas ya citadas. La figura 4 muestra la distribución de la concentración de cada precursor en función del tratamiento y el pH de la solución. En general, parece evidente el efecto de la degradación de los precursores por el tratamiento con ultrasonidos, más pronunciado a pH bajos.
Más en detalle, respecto a los precursores cisteinilados, se observa una disminución significativa del precursor de la 4MMP a pH 3.0, aproximadamente del 8%. Los resultados son coherentes con los obtenidos en las uvas (fig. 3) donde en Sauvignon Blanc, el precursor cisteinilato de 4MMP se vio más afectado por el tratamiento que el Cys-3MH. Además, en relación a este último precursor se observó una extracción neta positiva en Gewürztraminer (pH mayor), mientras que no se encontró ningún efecto en Sauvignon Blanc (pH menor).
La disminución causada por el tratamiento con ultrasonidos es más evidente en relación con los precursores glutationilados para los cuales la degradación de los precursores es significativa a ambos pH. Estos resultados son también consistentes con los reportados en las pruebas de extracción en las uvas, en las que los precursores ligados al glutatión parecen estar más influenciados por el tratamiento con ultrasonidos: efecto extractivo neto imperceptible en Gewürztraminer y una tendencia negativa en Sauvignon Blanc. Las diferencias observadas en el nivel de degradación a los dos niveles de pH son también congruentes con la hipótesis inicial por la que los ultrasonidos podrían interactuar con los precursores debido a la formación de radicales libres; la reducción media de precursores glutationilados a pH 3,0 fue mayor (~20% de media) que a pH 3.5 (~10%).
Desde un punto de vista enológico, la interacción con los precursores tendría sentido tecnológico sólo si entre los productos de degradación pudieran encontrarse las moléculas aromáticas libres. Los box-plot de la figura 5 demuestran como a la disminución de la concentración de precursores se acompañe de un claro y significativo incremento (p <0,05) de los compuestos aromáticos en ambos niveles de pH. La formación de tioles volátiles es más evidente a pH 3.0, lo que concuerda con una degradación más intensa de precursores a este pH. La tasa de formación de los compuestos libres con respecto a los precursores degradados (mol:mol) fue en promedio del 1.3 % a pH 3.0 y del 0.9% a pH 3.5. Estos valores no pueden ser sin embargo extrapolados del contexto experimental a condiciones industriales, ya sea por el diferente potencial redox del mosto o por la posible pérdida de compuestos volátiles causada por el efecto stripping de las burbujas creadas por cavitación. No obstante, cabe señalar que estos valores están dentro del normal orden de magnitud de liberación a cargo de las levaduras a partir de los precursores presentes en el mosto, que raramente supera el 3%.
Conclusiones
Los resultados de este trabajo han permitido destacar sensorialmente la posibilidad de sustituir la maceración prefermentativa con el tratamiento de ultrasonidos, lo que permitiría reducir los riesgos asociados a esta práctica enológica en cuanto al desarrollo de microorganismos indeseables y de disponibilidad de volumen para maceración o de frigorías. La confirmación del efecto positivo sobre los mecanismos de extracción de uvas de la fracción fenólica y su dependencia del tiempo de tratamiento hacen que sea posible modular el efecto en función de los objetivos enológicos a través de las variables de proceso.
Las investigaciones realizadas a nivel de laboratorio han puesto de manifiesto la posible degradación de los precursores tiólicos determinados por el tratamiento, más evidente en el caso de los glutationilados y a pH del mosto más bajos. Esta degradación va acompañada de un aumento en los compuestos aromáticos 3MH y 4MMP. Es todavía necesario estudiar en profundidad los mecanismos de interacción y los efectos de los ultrasonidos aplicados a nivel industrial para que estos resultados puedan ser utilizados en la optimización de los protocolos de vinificación específicos de cada variedad y que permitan mejorar la expresión aromática y la tipicidad de los vinos caracterizados por esta familia de compuestos.
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Texto extraído del artículo original en inglés “Wine acidification methods:..
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