C Pascal1, N Champeau1, E Charpentier1, E Brenon1, JB Diéval1, S Vidal , M Moutounet2
1 Vinventions, equipo vinícola, Francia
2 Consultor autónomo, Montpellier, Francia
Abstract
La longevidad de los vinos depende de su evolución oxidativa, más o menos rápida en determinadas condiciones, y de la aceptabilidad de la presencia de signos de oxidación para un perfil organoléptico determinado. Determinar la susceptibilidad de los vinos a la oxidación, es decir, el riesgo de que aparezcan notas oxidativas en contacto con el oxígeno, tiene un interés práctico para controlar mejor la vinificación, la crianza en depósito/madera y el envejecimiento en botella, así como para elegir conscientemente las operaciones realizadas en los vinos.
El objetivo de este trabajo es desarrollar un método para evaluar la sensibilidad de los vinos a la oxidación. Para ello, se implementó el método de ensayo de resistencia al aire con seguimiento electroquímico de una serie de vinos cuya sensibilidad a la oxidación había sido previamente clasificada por enólogos experimentados. La variación de la señal electroquímica del vino entre el contacto con el aire y después de 2 horas de contacto se utilizó para clasificar las muestras sensibles o, por el contrario, resistentes a la oxidación. Para comprender el origen de estas variaciones de señal, se realizaron medidas electroquímicas en soluciones de catequina, elegida aquí como compuesto fenólico modelo, en presencia de iones Fe(II) o Fe(III) en condiciones anóxicas. La mayor o menor capacidad de las semiquinonas, productos de oxidación de los compuestos fenólicos, para formar complejos con iones Fe(II) podría impedir que estos últimos reaccionaran según la reacción de Fenton y evitar así la formación de marcadores de oxidación en los vinos.
Uno de los principales retos del enólogo es evaluar la capacidad de un vino para resistir la aparición de signos de oxidación, con el fin de adaptar la vía técnica a su perfil objetivo y a su vida útil.
In pratica, i segni dell’ossidazione nei vini sono descritti come un cambiamento di colore con la comparsa di sfumature arancioni, un cambiamento aromatico descritto come una perdita di note varietali (bosso, frutto della passione) e/o la comparsa di note cosiddette ossidative (miele, cera, cioccolato, pietra, frutta secca, erba secca, noci, ecc.), e talvolta un cambiamento dell’equilibrio gustativo con un aumento dell’astringenza e/o una perdita di grasso. Questi diversi segni di ossidazione possono comparire in successione o contemporaneamente, senza che la comparsa di uno di questi segni sia indicativa della possibile comparsa di un altro.
El punto en el que un vino se considera oxidado depende de la aceptabilidad de estas características en relación con el tipo de producto y la intención del enólogo. Por ejemplo, la presencia de notas de frutos secos en vinos naturalmente dulces (por ejemplo, vinos con pasas) es aceptable, si no deseable, pero no en vinos secos de Sauvignon Blanc de determinadas denominaciones, que deben conservar notas cítricas o de frutas exóticas.
Evaluar la capacidad de un vino para resistir la oxidación equivale a determinar mediante una prueba predictiva su capacidad de envejecimiento y su longevidad, siempre que se almacene en las condiciones adecuadas.
En el vino, ciertas moléculas son conocidas por sus capacidades antioxidantes, por ejemplo, los compuestos fenólicos o los antioxidantes añadidos durante el proceso, como los sulfitos. En consecuencia, se ha considerado que la evaluación de la concentración de antioxidantes puede predecir la longevidad de un vino. La evaluación puede realizarse mediante diferentes métodos, que generalmente consisten en evaluar la capacidad del vino para captar radicales, para reaccionar con diferentes tipos de oxidantes (ensayo DPPH, ABTS, FRAP, análisis Folin Ciocalteu) o para oxidarse en electrodos de un determinado tipo (voltamperometría). Por último, se ha demostrado que el contenido antioxidante de un vino está fuertemente correlacionado con la concentración de compuestos fenólicos (Büyüktuncel et al. 2014; Romanet et al. 2019; de Beer et al. 2004, 2006; Kilmartin 2001).
Varios estudios han demostrado que la concentración de antioxidantes disminuye a medida que los vinos se oxidan (Rodrigues et al. 2007, Ugliano 2013 y 2019). En general, los vinos más viejos contienen menos antioxidantes que los más jóvenes (Rodrigues et al. 2007), pero la variabilidad de las añadas y de los procesos de vinificación (especialmente las etapas de extracción de los compuestos fenólicos) hace que la edad de un vino no pueda determinarse por su concentración de antioxidantes (Romanet et al. 2019). Por último, el bajo contenido en antioxidantes de un vino se ha correlacionado con la presencia en los perfiles sensoriales de notas asociadas a la evolución oxidativa de los vinos (Romanet et al. 2019). Sin embargo, estos estudios no demuestran que el contenido de antioxidantes sea predictivo de la capacidad de un vino para resistir la oxidación.
Para establecer una conexión con las prácticas enológicas, si el contenido intrínseco de compuestos fenólicos (los principales contribuyentes al contenido antioxidante) fuera un indicador de la capacidad de un vino para resistir la aparición de notas oxidativas, los enólogos utilizarían para ello el índice de Folin o incluso el índice de polifenoles totales. En cambio, los enólogos evalúan actualmente esta capacidad de forma empírica mediante la cata antes y después del contacto con el aire (prueba de resistencia al aire). Se evalúan los cambios en el perfil sensorial del vino, en particular la aparición de notas consideradas oxidativas.
Este artículo presenta el desarrollo de un método para determinar la sensibilidad de los vinos a la oxidación. Muestras de vino fueron seleccionadas empíricamente por enólogos y sometidas a una prueba de resistencia al aire controlada por voltamperometría de barrido lineal. Se observó una evolución diferente de la señal voltamperométrica para los vinos clasificados empíricamente como resistentes a la oxidación y sensibles a la oxidación. Por último, se registró la señal voltamperométrica de la catequina en solución hidroalcohólica en presencia y en ausencia de iones Fe(II) y Fe(III) en atmósfera inerte, lo que permitió avanzar hipótesis sobre la implicación de compuestos fenólicos-iones Fe(II) o Fe(III) en los registros obtenidos y sobre los mecanismos subyacentes a este ensayo.
Materiales y métodos:
134 muestras de vino (87 tintos, 32 blancos y 15 rosados de diferentes regiones francesas y españolas) fueron seleccionadas al final de la fermentación alcohólica o maloláctica por enólogos experimentados (jefes de bodega o enólogos asesores con varios años de experiencia en la zona de producción en cuestión y que suelen incluir la microoxigenación en algunos de sus protocolos técnicos). Para cada muestra, el enólogo evaluó empíricamente mediante cata el riesgo de oxidación prematura del vino, clasificándolo como resistente o sensible a la oxidación. Las muestras de vino se tomaron de botellas de 750 ml previamente inertizadas, llenadas hasta rebosar y cerradas con tapón de rosca. Estos vinos se sometieron a una prueba de resistencia al aire tomando 50 ml de muestra con una pipeta volumétrica y colocándola en una botella de 125 ml. Se realizaron medidas de voltamperometría lineal de barrido (0-600 mV, 100 mV/s, pasos de 10 mV) al abrir la botella y después de 2 horas, utilizando un potenciostato (WQS Polyscan, Vinventions), en electrodos moldeados (electrodo de trabajo de carbono, Vinventions). Los potenciales se expresan en relación con un electrodo de referencia Ag/AgCl.
Las soluciones de catequina (1150,0 mg/L y 1165,0 mg/L), sulfato de hierro (10,3 mg/L) y cloruro de hierro (10,7 mg/L) se prepararon en etanol al 13% que contenía 4,0 g/L de ácido tartárico y se ajustaron a pH 3,3 con HCl 1N y luego 0,1N. Estas soluciones madre se desairearon mediante burbujeo de nitrógeno y se colocaron en una campana de humos inerte mediante lavado con nitrógeno. El % de O2 en la campana se controló con un Nomasense O2 P300 (Vinventions) y se mantuvo por debajo del 2% durante todo el ensayo. Las curvas de intensidad-potencial de las soluciones madre recién preparadas y de la mezcla 50/50 v/v de catequina/ión Fe se registraron por triplicado como se ha descrito previamente utilizando voltamperometría de barrido lineal.
Resultados
Empíricamente, la prueba de resistencia al aire sólo la realizan los enólogos en muestras que no han estado en contacto con el oxígeno en los días anteriores. 2 Para aproximarnos a estas condiciones, las pruebas de resistencia al aire sólo se realizaron aquí en muestras almacenadas durante 3 semanas antes de la medición en ausencia de O . El 58% de las muestras seleccionadas por los enólogos se clasificaron empíricamente como resistentes a la oxidación.
La comparación de las curvas intensidad/potencial obtenidas en un vino inmediatamente después de abrir la botella de muestra con las obtenidas tras 2 horas de contacto con el aire reveló varios cambios en las señales.
Para 47 de los 134 vinos, se observó un aumento significativo de la intensidad (superior al 5%, la incertidumbre de medida del método) en el intervalo de 100-600 mV en la medida después de 2 horas de contacto con el aire (Figura 1 (a)). Las 47 muestras de este grupo habían sido caracterizadas como resistentes a la oxidación por los enólogos. Ninguna de las muestras «sensibles a la oxidación» mostró este comportamiento.
Figura 1: Curvas intensidad/potencial medidas de un vino cuando la muestra se pone en contacto con el aire (T0) y después de 2 horas de contacto. (a) muestras descritas como resistentes a la oxidación por los enólogos (b) muestras descritas como sensibles a la oxidación por los enólogos. (a1) e (b1): vinos tintos. (a2) e (b2): vinos rosados. (a3) e (b3): vinos blancos.
Sin embargo, en 38 de las 147 muestras se observó una disminución significativa de la intensidad (superior al 5%, la incertidumbre de medición del método) en el intervalo de 100-600 mV en la medición realizada después de 2 horas de contacto con el aire (Figura 1 (b)). Estos 38 vinos habían sido caracterizados como sensibles a la oxidación por los enólogos. Ninguna de las muestras caracterizadas como «resistentes a la oxidación» mostró este comportamiento.
Para los 49 vinos restantes, la variación de intensidad entre la medición inicial y la registrada tras 2 horas de contacto con el aire no fue significativa. Estos vinos podrían tener potencialmente un comportamiento menos oxidativo que las 2 categorías descritas anteriormente, haciendo que la prueba fuera menos sensible a su discriminación. Además, no se exigió ninguna escala de intensidad para la resistencia o la sensibilidad a la oxidación en la categorización de los vinos, lo que significa que no fue posible distinguir esta categoría de vinos, definida posteriormente como «intermedia».
La prueba parece ser capaz de clasificar los vinos:
las que muestran un aumento de la señal entre la medición inicial y la realizada tras 2 horas de contacto con el aire parecen ser sistemáticamente resistentes a la oxidación,
las que muestran una disminución de la señal entre estas dos mediciones parecen ser sistemáticamente sensibles a la oxidación.
Impacto de la complejación de iones Fe(II) y Fe(III) por compuestos fenólicos en la señal voltamperométrica
En un intento de explicar el mecanismo químico que subyace a la prueba, se llevaron a cabo trabajos adicionales en una solución modelo, en un medio inerte. A título informativo, se ha demostrado (Kilmartin et al. 2002, Ugliano et al. 2019) que la voltamperometría de electrodos de carbono puede utilizarse para analizar compuestos fenólicos.
También se consideró que el mecanismo de oxidación en los vinos (Figura 2) subyace en el ciclo redox del par Fe(II)/Fe(III) (Ribereau Gayon 1931, Danilewicz 2018, du Toit et al. 2006, Waterhouse y Laurie 2006).
Además, se sabe que estos mismos iones Fe(II) y Fe(III) forman complejos con compuestos fenólicos, en particular estructuras con un anillo B di- o tri-hidroxilado (Amorim Porfírio et al 2014). 2+2+Recientemente, varios estudios (Le Nest et al. 2004, Amorim Porfírio et al 2014) han demostrado que los complejos entre compuestos fenólicos y algunos iones metálicos (Zn , Fe ) pueden presentar curvas de intensidad/potencial que difieren de las del compuesto fenólico en ausencia de iones metálicos. La señal del complejo suele ser mayor. En estos estudios se analizaron varios compuestos fenólicos modelo (morina, quercetina, fisetina, catequina, crisina, taxifolina, etc.), que muestran diferentes impactos de la complejación en las respectivas señales voltamperométricas. Sin embargo, estos estudios se realizaron a pH neutro para reproducir las condiciones fisiológicas y no muestran la señal del complejo fenólico-Fe(III). Dado que el vino tiene un pH ácido y que se sabe que los ácidos orgánicos, en particular el ácido tartárico, forman complejos de iones Fe(II) y Fe(III), se registró la señal voltamperométrica de la catequina, elegida como compuesto fenólico modelo para este estudio, en una solución de vino modelo (solución hidroalcohólica al 13%, 4 g/L de ácido tartárico, pH 3. 5) antes y después de la adición independiente de iones Fe(II) y Fe(III) en atmósfera inerte para evitar que se instale el mecanismo de oxidación (realizado en una vitrina de gases inerte con flujo de nitrógeno, soluciones previamente desaireadas). La adición independiente de iones Fe(II) y Fe(III) a la solución de catequina produjo cambios en la curva de intensidad de potencial registrada para la catequina sola (Figura 3), lo que sugiere que la complejación de iones catequina-Fe(II) y Fe(III) tuvo lugar efectivamente en las condiciones del vino modelo y repercutió en la señal voltamperométrica. Se observó que la señal voltamperométrica del complejo catequina-Fe(II) era cercana a la de la catequina (Figura 3 (b)), como observaron Porfirio et al (2014), o incluso ligeramente inferior entre 450 y 500 mV. Por el contrario, la señal del complejo catequina-Fe(III) fue significativamente mayor que la de la catequina sola entre 450 y 600 mV (Figura 3 (a)).
Figura 3: Curvas de intensidad de potencial para : (a) catequina (1150mg/L, solución hidroalcohólica al 13%, pH 3,3, 4g/L de ácido tartárico) en ausencia o presencia de iones Fe(III) (5 mg/L) (b) catequina (1165mg/L, solución hidroalcohólica al 13%, pH 3,3, 4g/L de ácido tartárico) en ausencia o presencia de iones Fe(II) (5 mg/L).
La complejación de los iones Fe(II) hace que estén menos dispuestos a participar en la reacción de Fenton.
En consecuencia, se han planteado las siguientes hipótesis para explicar la evolución de las curvas intensidad-potencial de un vino determinado tras 2 horas de contacto con el aire.
La primera medición se realiza inmediatamente después de abrir la muestra, que se ha almacenado durante un mínimo de 3 semanas en condiciones anóxicas después de haber sido tomada en condiciones inertes. En estas condiciones, los iones de hierro se encuentran a priori principalmente en la forma Fe(II) (Danilewicz, 2016 y 2018, Nguyen & Waterhouse 2019). Por lo tanto, la señal voltamperométrica corresponde a priori a la de compuestos fenólicos o complejos compuestos fenólicos-Fe(II), en función de la capacidad de los compuestos fenólicos presentes para complejar iones Fe.
ras 2 horas de contacto con el aire, comenzó el mecanismo de oxidación (Figura 3), que dio lugar a la oxidación de Fe(II) a Fe(III) y a la reducción de oxígeno a peróxido de hidrógeno (Ribereau Gayon 1931, Danilewicz 2018, du Toit et al. 2006, Waterhouse y Laurie 2006). Cuando se observa un aumento de la señal, esto podría atribuirse a la contribución de los complejos fenólicos-Fe(III), cuya señal parece ser mayor que la de los complejos fenólicos-Fe(II), según los registros realizados en soluciones de catequina. Esto significaría que los vinos clasificados como resistentes a la oxidación por esta prueba poseen un pool de compuestos fenólicos capaces de formar complejos con iones Fe en las condiciones ambientales de estos vinos. El efecto de los quelantes metálicos exógenos para estabilizar los vinos frente a la oxidación fue considerado por Kreitman et al. (2013) tras un estudio en soluciones modelo. Además, en un contexto fisiológico, Lopes et al. (1999) sugirieron que el ácido tánico limita la oxidación de la 2-desoxirribosa, un componente del ADN, debido a su capacidad para quelar iones Fe, haciendo que los iones Fe(II) no estén disponibles para participar en la reacción de Fenton y limitando así la formación de radicales HO° hidroxilo. En el caso de los vinos resistentes, es posible que los iones Fe(II) (Figura 4) permanezcan complejados a la semiquinona (Perron et al. 2009 y 2010), la forma oxidada del compuesto fenólico que ha reducido un ion Fe(III) a un ion Fe(II). Non ci sarebbe un proseguimento del meccanismo verso una forma chinonica che ha ridotto 2 ioni Fe(III) e gli ioni Fe(II) resterebbero complessati ai composti fenolici. Perron et al. (2010) hanno anche suggerito che la stabilità del complesso composto fenolico-Fe(III) favorirebbe l’autossidazione del Fe(II) complessato. Gli ioni Fe(II) potrebbero quindi essere meno disponibili a reagire con il perossido di idrogeno e dare origine alla reazione di Fenton, il che spiegherebbe la minore comparsa di note descritte come ossidative quando questi vini sono a contatto con l’ossigeno.
Por otra parte, cuando la señal del vino disminuyó tras 2 horas de contacto con el aire, es probable que el mecanismo de oxidación condujera a la formación de quinonas, formas oxidadas de compuestos fenólicos que no pueden contribuir a la señal voltamperométrica en la zona de potencial considerada. El conjunto de compuestos fenólicos en las condiciones ambientales de estos vinos no podría retener iones Fe complejados (Figura 4). Los iones Fe(II) podrían entonces reaccionar con el peróxido de hidrógeno para iniciar la reacción de Fenton (Singleton 1987) y dar lugar a radicales de muy alta energía, los radicales HO° hidroxilo que oxidan el etanol a etanal, por ejemplo. Sin ánimo de ser exhaustivos, también se ha planteado la hipótesis de que los radicales hidroxilo dan lugar a la aparición de pigmentos marrones/amarillos/naranjas relacionados con reacciones de condensación de flavan-3-oles (taninos) en presencia de etanal o ácido pirúvico (Oszmianski 1996, Fulcrand 1996, Guyot 1996) o atacan a compuestos con funciones alcohólicas dando lugar a la formación de los denominados aldehídos de oxidación (metional, fenilacetaldehído) (Nikolantonaki y Waterhouse 2012).
Conclusión:
En conclusión, la determinación de la susceptibilidad de un vino a la oxidación es de gran interés para los enólogos, ya que tiene por objeto adaptar mejor el método de vinificación y las condiciones de almacenamiento al perfil deseado de cada producto. La prueba de resistencia al aire es un método empírico para evaluar de forma sencilla esta resistencia. Cuando esta prueba se controla mediante voltamperometría lineal, el cambio de señal entre el momento del contacto con el aire y las 2 horas de contacto puede utilizarse para identificar los vinos resistentes a la oxidación, que muestran un aumento de la señal voltamperométrica, y los vinos sensibles a la oxidación, que muestran una disminución. Estos cambios en las señales podrían estar relacionados con la mayor o menor capacidad de los compuestos fenólicos del vino para formar complejos con iones Fe, con la complejación dando lugar a una mayor señal voltamperométrica para el complejo fenólico-Fe(III) y haciendo que los iones Fe(II) estén menos disponibles para generar la reacción de Fenton. Además de la conexión entre los resultados de las mediciones voltamperométricas y la clasificación empírica de los vinos por los enólogos, se sometieron a esta prueba vinos blancos y tintos, embotellados después de forma controlada y almacenados para verificar el carácter predictivo de la prueba. Estos estudios, que confirman la posibilidad de evaluar la sensibilidad de los vinos a la oxidación, se publicarán en un próximo artículo
Amorim Porfírioa D., de Queiroz Ferreiraa R., Renata Malagutti A., Maíra Agostini Valle E., (2014) Electrochemical study of the increased antioxidant capacity of flavonoids through complexation with iron(II) ions, Electrochimica Acta, 141, 33–38.
Büyüktuncel E., E Porgalı, C Çolak, Comparison of Total Phenolic Content and Total Antioxidant Activity in Local Red Wines Determined by Spectrophotometric Methods Food and Nutrition Sciences, 5 (17), 1660-1667
Danilewicz J.C. (2007) Interaction of Sulfur Dioxide, Polyphenols, and Oxygen in a Wine-Model System: Central Role of Iron and Copper. Am. J. Enol. Vitic. 58:1, 53-60.
Danilewicz J.C. (2018) [Fe(III)]:[Fe(II)] Ratio and Redox Status of Red Wines: Relation to So-Called “Reduction Potential” Am. J. Enol. Vitic. 69:2, 141-147.
Danilewicz J.C. (2016) [Fe(III)]:[Fe(II)] Ratio and Redox Status of White Wines Am. J. Enol. Vitic. 67:2, 146-152.
De Beer D., J F. Harbertson, P A. Kilmartin, V Roginsky, T Barsukova, D O. Adams, A L. Waterhouse Phenolics: A Comparison of Diverse Analytical Methods Am J Enol Vitic. 2004, 55, 389-400
du Toit W.J., Marais J., Pretorius I.S. and du Toit M. (2006) Oxygen in must and wine: A review. S Afr J Enol Vitic 27, 76-94.
Kilmartin, P.A.; Zou, H.; Waterhouse, A.L. A Cyclic Voltammetry Method Suitable for Characterizing Antioxidant Properties of Wine and Wine Phenolics. J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 1957–1965.
Kilmartin P.A., Zou H, Waterhouse A.L. (2002) Correlation of wine phenolic composition versus cyclic voltammetry response, Am. J. Enol. Vitic. 53, 294-302.
Kreitman G.Y., Cantu A., Waterhouse A.L., Elias R.J. (2013) The effect of metal chelators on the oxidative stability of model wine J. Agric. Food Chem. 61(39), 9480-7.
Lopes G.K., Schulman H.M., Hermes-Lima M. (1999) Polyphenol tannic acid inhibits hydroxyl radical formation from Fenton reaction by complexing ferrous ions. Biochim Biophys Acta. 1472(1-2),142-52.
Nguyen T.H., Waterhouse A.L. (2019) A Production-Accessible Method: Spectrophotometric Iron Speciation in Wine Using Ferrozine and Ethylenediaminetetraacetic Acid. J. Agric. Food Chem. 67, 2, 680–687.
Le Nest G., Caille O., Woudstra M., Roche S., Guerlesquin F., Lexa D. (2004) Zn–polyphenol chelation: complexes with quercetin, (+)-catechin, and derivatives: I optical and NMR studies. Inorganica Chimica Acta 357 (3), 775-784
Perron N.R., Brumaghim J.L. (2009) A review of the antioxidant mechanisms of polyphenol compounds related to iron binding. Cell Biochem Biophys. 53(2),75-100.
Perron N.R., Wang, H.C., DeGuire S.N., Jenkins M., Lawson M., Brumaghim J.L. (2010) Kinetics of iron oxidation upon polyphenol binding. Dalton Trans. 39, 9982-9987.
Ribéreau-Gayon J. (1931) Contribution à l’étude des oxydations et réductions dans les vins. Thèse Doctorat ès Sciences Physiques, Bordeaux.
Romanet R., C Coelho, Y Liu, F Bahut, J Ballester, M Nikolantonaki, R D. Gougeon The Antioxidant Potential of White Wines Relies on the Chemistry of Sulfur-Containing Compounds: An Optimized DPPH Assay Molecules 2019, 24(7), 1353
Rodrigues A., Silva Ferreira A.C., Guedes de Pinho P., Bento F., Geraldo D. Resistance to Oxidation of White Wines Assessed by Voltammetric Means J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 10557–10562
Ugliano M., Dieval J-B, Tacchini P., Vidal S. Oxidation fingerprints of white wines by linear sweep voltammetry using screen printed carbon electrochemical sensors. 2013, In Vino Analytica Scientia, poster
Ugliano M., Pascal C., Diéval J-B., Vidal S., Wirt J., Bégrand, S. Une nouvelle approche voltamétrique pour l’analyse des polyphénols des raisins blancs et le suivi des opérations pré-fermentaires. Infowine 2019
Waterhouse A.L. and Laurie V.F. (2006) Oxidation of wine phenolics: A critical evaluation and hypotheses. Am J Enol Vitic 57, 306-313.
