Análisis de la actividad biológica y cantidad de microorganismos en suelos vitivinícolas

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Desde los trabajos de referencia de Winogradsky (1949) y Pochon y Barjac (1958), la microbiología del suelo nunca había sido tan popular como en los últimos años. Muchos esfuerzos en investigación se has dedicado a este campo y las publicaciones sobre el tema se multiplican. Los enfoques son tan dispares como los sistemas estudiados complejos. Algunas técnicas utilizadas pueden ser relativamente ubicuas (la famosa técnica canadiense de los calzoncillos bio de algodón ...) o infinitamente sofisticadas (enfoque metagenómico...) a veces incluso a expensas de ciertos axiomas agronómicos (representatividad de la muestra, profundidad de muestreo...) o analíticas (retraso entre la toma de la muestra y la realización del análisis, negligencia de ciertos efectos ambientales (temperatura, humedad...).

Cuando comenzamos a realizar reflexiones sobre la materia en los laboratorios Excell, nuestra principal ambición era proponer un dispositivo analítico integral, práctico y pragmático. En la inmensidad de la diversidad de mohos, bacterias y otras levaduras presentes sobre y en el interior de los suelos, dos compuestos químicos comunes a todas estas células están representando, primero su presencia, y en segundo lugar, su actividad. Se trata de las cantidades totales de ADN y ATP respectivamente. Estas dos biomoléculas son universales para cualquier organismo vivo.

Mediante la eliminación de organismos vivos visibles a simple vista (un microorganismo es por definición un organismo invisible) y mediante la dosificación de ADN y ATP, es posible evaluar la cantidad total de microorganismos (toda célula microbiana tiene ADN, excepto ciertos virus que solo tienen RNA) y su nivel de actividad (el ATP es la molécula responsable de la energía celular; por lo tanto, su cantidad total representa la vitalidad general del consorcio microbiano presente). La tabla 1 resume las ventajas de estos dos enfoques complementarios en comparación con otras técnicas existentes.  

Tabla 1: Síntesis de los diferentes enfoques analíticos en la caracterización de la vida microbiana de un suelo y sus beneficios: análisis del ATP (vitalidad) y del ADN (carga microbiana total).

La relación ATP-DNA potencialmente también puede proporcionar información muy interesante. El suelo que tiene cantidades significativas de ADN, pero valores de ATP relativamente bajos, podría poner en evidencia su funcionamiento: ¿por qué están presentes los gérmenes, pero no están activos? ¿Presencia de compuestos tóxicos? ¿Deficiencia de nutrientes?, ¿en este o aquel elemento mineral?  ¿Exceso de agua?

Una vez establecidos y optimizados los métodos de funcionamiento analítico, hemos acumulado muchas medidas en los últimos 3 años con el fin de crear una base de datos sólida que sirva para interpretar los resultados y así compararlos con datos complementarios. Este artículo detalla el trabajo realizado evocando los principales principios de estos análisis y luego presentando algunos ejemplos concretos de los resultados obtenidos, revelando el fuerte potencial que tienen estos análisis como herramienta de diagnóstico, pero también como utensilio en la toma de decisiones para guiar las prácticas agronómicas más adecuadas a nivel vitícola. 

Materiales y métodos:

Las muestras de tierra se realizan con ayuda de materiales de muestreo clásicos (barrena, pequeñas palas, plantadora de mano...) previamente limpiados. Las muestras se toman bajo la yacija vegetal a 20/30 centímetros de profundidad. En el laboratorio se eliminan todos los elementos biológicos visibles a simple vista (vegetales, insectos, lombrices de tierra...). La humedad de la tierra se mide entonces y la tierra se disuelve en condiciones definidas y el ATP y el ADN se miden con dispositivos específicamente dedicados. Las determinaciones de cobre en los suelos mencionados también en los resultados presentados en este artículo se realizan a partir de protocolos normalizados (cobre total: norma ISO 11466; cobre intercambiable NF X31-120).

Resultados:

En el cuadro que figura a continuación (Tabla 2) se resumen los datos acumulados de las mediciones de ATP en el suelo en los últimos tres años. La medida del ATP se expresa en RLU (gracias a una enzima, la luciferasa (enzima presente en las luciérnagas), la cantidad de ATP se transforma en intensidad luminosa. Los valores registrados dependen, por supuesto, del procedimiento utilizado y del aparato de medición. Solíamos utilizar esta técnica en nuestras auditorías de higiene en los sótanos. Para los análisis de suelo el contexto es obviamente totalmente diferente (incluyendo el procedimiento analítico). En particular, hemos optado por transcribir la medida de RLU en cantidad de ATP por gramo de materia seca (suelo). Los miles de datos acumulados (Tabla 2 y Figura 1) estos dos últimos nos permiten estimar que por debajo de 50 RLU el suelo estudiado es «muy pobre» en vitalidad biológica; que entre 50 y 100 RLU la vitalidad biológica es «baja» entre 100 y 200 puede considerarse «media», entre 200 y 400 RLU la vitalidad biológica se califica de «fuerte» y más allá de 400 RLU de «muy fuerte».

Tabla 2: Valores clave de la base de datos de vitalidad biológica por mediciones ATP expresadas en ng por g de materia seca. Realizadas en diferentes viñedos desde 2018.

Figura 1: Detalle de la base de datos de análisis de vitalidad biológica de suelos mediante medición de ATP en los últimos 3 años.

Ejemplos de resultados obtenidos:

El gráfico de la Figura 2 muestra los resultados obtenidos en diferentes lugares de una parcela de Merlot en Libourne a principios de primavera (muestras de marzo) y a mediados de verano (muestras de julio). Es interesante observar que los niveles de vitalidad orgánica fueron generalmente relativamente altos en primavera, que disminuyeron significativamente a mediados del verano y que el lugar con el nivel más bajo de vitalidad en marzo fue el que tenía el nivel más alto de vitalidad a mediados de julio. Esta parcela corresponde a la parte menos arcillosa.

Figura 2. Comparación de los análisis de vitalidad biológica (ATP) en 6 puntos de muestreo de una misma parcela de Merlot en el Líbano entre principios de marzo (primer punto de medición en azul) y mediados de julio (segundo punto de medición en verde).

 Entre los compuestos del suelo probablemente hostiles a la vida microbiana, el cobre está evidentemente en el centro de todos los cuestionamientos. Muchas publicaciones mencionan este tema (Karimi et al 2021; Nunes et al. 2016 Wang et al. 2009) pero los resultados propuestos son divergentes. Algunos datos se basan en fuertes consecuencias de la presencia de cobre sobre la riqueza (biomasa, diversidad...) microbiana y otros demuestran que el cobre no tiene un efecto significativo sobre las vías metabólicas centrales y esenciales, como la actividad beta-glucosidasa implicada en el ciclo del carbono y la degradación de la materia orgánica. Estos estudios tienen a menudo por objeto correlacionar la dosis de cobre empleada con la estación y la vida microbiana en el suelo. A partir de nuestros indicadores de ATP y ADN, hemos buscado estudiar los efectos de los contenidos reales de cobre total e intercambiable en el suelo en el momento del análisis microbiológico.

La primera nube de puntos, en la Figura 3, presenta los resultados obtenidos en 80 análisis realizados en diferentes parcelas de 5 viñedos (Bordelés y de Languedoc) pertenecientes a una misma estructura. Se observa una tendencia: las tierras con las mayores vitalidades biológicas son las que tienen los niveles más bajos de cobre intercambiable. Esta primera serie de análisis se realizó en el verano de 2020. En diciembre de 2020 se llevó a cabo una segunda campaña de análisis que consolidó la observación con el doble de puntos de medición; indicar aquí que los valores de cobre total y de cobre intercambiable están sólidamente correlacionados pero que se observan variaciones notables entre los dos puntos de medida (verano y principios del invierno) que reflejan sin duda una diferencia en la capacidad de retención del cobre según los suelos estudiados.

Figura 3 y 4. Comparación entre las medidas de vitalidad biológica (ATP) y las de cobre intercambiable y cobre total.

El estudio de otros residuos de plaguicidas en el suelo también puede ser interesante para comprender las diferencias en los resultados de vitalidad biológica. En el cuadro de la Tabla 3 a continuación se comparan los datos de vitalidad biológica y el tipo de residuos de plaguicidas y sus concentraciones en diferentes parcelas de un mismo viñedo. Las Figuras 5 y 6 siguientes agrupan las parcelas según su nivel de vitalidad biológica. Observamos que las que presentan una vitalidad biológica inferior a 100 ng de ATP/g de suelo (por lo que pueden calificarse de relativamente baja) son las que presentan el número de residuos y la suma de las concentraciones de residuos más elevadas (aunque, por supuesto, este tipo de explotación de los datos relativos a los plaguicidas está siempre sujeta a ciertas precauciones y a nociones de toxicidad de las que no somos expertos).

Tabla 3: Ejemplo de resultados obtenidos en análisis de vitalidad biológica (ATP), pH, cobre total e intercambiable y residuos de plaguicidas (de una lista de unos 180 compuestos buscados en diferentes parcelas de muestreo de un mismo viñedo. Los plaguicidas se expresan en mg/kg MS.

Figura 5 y 6. Ilustración gráfica de los resultados del cuadro de la Tabla 3 agrupando las parcelas de muestreo según sus resultados de mediciones de vitalidad biológica (ATP) y el número de plaguicidas cuantificados y la suma de las concentraciones recuperadas.

Como se ha mencionado en la introducción, la medición de la vitalidad biológica estimada por la cantidad de ATP puede compararse con la cantidad de microorganismos presentes. Para estimar esta magnitud elegimos referirnos a la determinación del ADN microbiano total. En la Tabla 4 se comparan dos muestras de un mismo viñedo que, aunque presentan una cantidad de ADN microbiano total similar, presentan dos niveles de vitalidad biológica radicalmente diferentes. Estas dos muestras se realizaron con dos tipologías de suelos muy diferentes, asociadas igualmente a dos modos de conducción y de trabajo del suelo diferentes.

Estos resultados apuntan a que, para una carga microbiana total relativamente similar, la vitalidad biológica y, por lo tanto, las actividades metabólicas de los microorganismos son mucho mayores en el punto de muestreo A. En este caso, evidentemente, conviene interrogarse sobre las causas de estas diferencias (hidromorfía de los suelos, concentraciones de nitrógeno, carbono, minerales, elementos tóxicos...) porque estas diferencias de actividad pueden ciertamente tener consecuencias sobre los ciclos de la materia y las posibilidades de asimilación para las cepas de vid que se encuentran en ella.

Tabla 4: Comparación de los valores de vitalidad biológica (medida del ATP) y de carga microbiana total (calculada mediante la medición del ADN) en dos lugares de toma de muestras de un mismo viñedo, pero con una tipología de suelo y modos de trabajo diferentes. Si la cantidad de ADN es similar, la vitalidad biológica se considera alta para el sitio A y baja para el sitio B.

Conclusiones y perspectivas:

De manera muy general, el consorcio microbiológico de los suelos es un elemento clave en el ciclo de la materia orgánica (Anfrey 2017). Cuanto más importante, diversificada y activa sea esta microflora, más rápido será el proceso de degradación de la materia orgánica y más nutrientes intermedios (minerales, inorgánicos y orgánicos) estarán disponibles para las cepas de vid. Por lo tanto, el análisis del componente microbiano de un suelo es de evidente interés, pero requiere cierta cautela, ya que los sistemas que deben estudiarse son complejos y se rigen por numerosas interrelaciones ecológicas.

Para disponer de datos precisos, globales y pragmáticos, en el laboratorio EXCELL, hemos optado por concentrar nuestras estrategias analíticas en dos magnitudes vinculadas a toda forma de vida microbiana: el ADN y el ATP. El ADN permite estimar la cantidad total de células microbianas presentes y el ATP representa la actividad de esta microflora.

Después de compilar los resultados de numerosos análisis en los últimos tres años, los niveles de vitalidad biológica pueden ahora distinguirse bien según las cantidades de ATP medidas. Estos análisis pueden poner importantes diferencias de nivel de actividad microbiana en los suelos en función de diferentes factores: tipología del Suelo, modo de trabajo de este último o la composición de elementos nutritivos o tóxicos. Entre estos últimos, las solicitaciones más frecuentes actualmente son las destinadas a confrontar la medida de vitalidad biológica con los contenidos de cobre residual presentes en el suelo.

En general, para ayudar en las observaciones de vitalidad biológica del suelo mediante el método ATP, la medición complementaria del ADN permite ponderar el nivel de actividad analizado. Observamos así que en algunos casos, donde las cantidades de ADN parecen relativamente altas, los niveles de vitalidad pueden ser bajos, lo que cuestionaría las causas y las consecuencias de tales prolepsis: si los microorganismos son bellos y están bien presentes (elevada cantidad de ADN) ¿Por qué no están activos?

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Referencias bibliográficas:

• Anfray, P. 2017. Guide Pratique de la vie des sols. Ed. France Agricole. Paris.
• Karimi, B., Masson, V., Guilland C., Leroy E., Pelligrinelli S., Giboulot E., Maron P.A., Ranjard, L., 2021. La biodiversité des sols est-elle impacter par l’apport de cuivre ou son accumulation dans les sols vignes ?
• Synthèse des connaissances scientifiques. Etude et gestion des sols, vol. 28 pages 71 à 92. 
• Nunes, I., Jacquiod. S., Brejnrod. A., Holm. P.E., Johansen, A., Brandt K.K., 2016. Coping with copper: legacy effect of cooper on potential activity of soil bacteria following a century of exposure. FEMS Microbiol. Ecol. 92. Fiw175.
• Pochon, J. et de Barjac H. 1958. Traité de microbiologie des sols, applications agronomiques. Ed. Dunod. Paris.Wang, Q.Y., Zhou D.M., Cang, L., 2009. Microbial and enzyme properties of apple orchard soil as affected by longterm application of copper fungicide. Soil Biol. Biochem. 41, 1504-1509.
• Winogradsky, S. 1949. Microbiologie du sol, problèmes et méthodes ; 50 ans de recherche. Ed. Masson. Paris.