Étude cinétique du brunissement causé par l'activité de la laccase à l'aide de différents substrats

A notre connaissance, toutes les études sur la cinétique de la laccase et son inhibition ont été réalisées avec des substrats et des conditions très différents de ceux du vrai jus de raisin. De plus, aucune de ces recherches ne mesure réellement le brunissement enzymatique, puisqu'elles n'ont pas pris en compte ce qui se passe après l'oxydation des o-diphénols en o-diquinones et leur polymérisation ultérieure pour former des mélanines.

C'est pourquoi l'objectif de cette recherche était de développer un nouveau modèle pour mesurer la cinétique du brunissement provoqué par la laccase de Botrytis cinerea dans des conditions beaucoup plus proches de celles du jus de raisin et en utilisant les substrats qui y sont naturellement présents. Une solution modèle de jus de raisin contenant 100 g/L de D-glucose, 100 g/L de D-fructose et 4 g/L d'acide tartrique ajusté à un pH de 3,5 a été utilisée pour tous les essais de brunissement.

Cinq composés phénoliques, dont un triphénol : l'acide gallique ; trois orthodiphénols : l'acide caftarique, la (+)-catéchine et la (-)-épicatéchine ; et un monophénol : l'acide 4-hydroxybenzoïque, ont été utilisés à des concentrations comprises entre 0 et 0,8 mM. La laccase de Botrytis cinerea a été purifiée. La réaction de brunissement a été démarrée en ajoutant 2 unités d'activité laccase/mL et l'absorbance à 420 nm a été mesurée au temps 0, 15, 30 et 45 minutes. La pente de la droite de régression a été déterminée afin d'exprimer l'intensité du brunissement. Les diagrammes de Michaëlis-Menten et de Hill ont été représentés pour chaque substrat afin de déterminer les paramètres cinétiques du brunissement : Vmax, K0,5 et nombre de Hill. Toutes les expériences ont été réalisées en trois exemplaires. Les résultats indiquent que les o-diphénols sont de meilleurs substrats pour le brunissement par la laccase que les triphénols et que les monophénols, ou au moins l'acide 4-hydroxybenzoïque, sont de meilleurs substrats pour le brunissement par la laccase que les triphénols. l'acide 4-hydroxybenzoïque, ne semblent pas être réactifs. De plus, parmi les o-diphénols, c'est la (+)-catéchine qui présente la plus forte intensité de brunissement, suivie par ordre décroissant par la (-)-épicatéchine et l'acide caftarique.

Cette recherche propose un modèle synthétique pour mesurer le brunissement de la laccase dans une matrice proche du jus de raisin réel qui permet d'étudier comment le brunissement de la laccase agit en présence de différents substrats possibles. D'autres études sont nécessaires pour vérifier l'efficacité du modèle proposé sur d'autres substrats de la laccase tels que les anthocyanines, les flavonols et les proantocyanidines, ainsi que pour déterminer l'effet inhibiteur sur le brunissement de la laccase des antioxydants les plus fréquemment utilisés - dioxyde de soufre, acide ascorbique et glutathion - et d'autres inhibiteurs possibles du brunissement de la laccase tels que les tannins œnologiques.

Poster présenté au congrès Macrowine virtual (23-30 juin 2021)