Studio anatomico di Vitis vinifera mediante micro tomografia a raggi X

Simone Codato, Silvia Guidoni, Claudio Lovisolo
Università degli Studi di Torino, Dipartimento di Scienze Agrarie, Forestali e Alimentari (DISAFA), Largo Paolo Braccini, 2, 10095 Grugliasco (TO)

Contatti e-mail: codato.simone@gmail.com; silvia.guidoni@unito.it; claudio.lovisolo@unito.it 

________________________________________________________________________________________

Introduzione

Lo sviluppo di strumenti e tecniche di analisi per immagini ha fin dall’antichità svolto un ruolo importante nello studio degli aspetti morfologici e funzionali di campioni biologici. In questo ambito il microscopio, dalla sua invenzione di fine XVI secolo, ha segnato una rivoluzione nella storia della scienza, grazie alla sua funzionalità fondamentale di ingrandimento, consentendo lo studio di dettagli non osservabili direttamente ad occhio nudo.

Nel susseguirsi dei secoli i grandi progressi in ambito tecnologico hanno permesso di mettere a disposizione nuove tecniche e di potenziarne le capacità, sfruttando la luce naturale visibile come energia di interazione con la materia nei microscopi ottici e nella fotografia, fasci di elettroni nei microscopi a scansione (SEM) e a trasmissione elettronica (TEM), fasci di raggi X (RX) nelle tecniche radiografiche fino alla luce di sincrotrone nei sistemi più avanzati.

Negli ultimi vent’anni le tecniche di micro tomografia computerizzata ad alta risoluzione a raggi X (Micro Computed X-Ray Tomography, μCT) si sono imposte come uno dei più versatili ed efficaci mezzi nello studio delle strutture costituenti le specie vegetali. Da applicazione tipicamente industriale e di medicina diagnostica umana e animale, a partire dagli inizi degli anni 2000, questa tecnica ha trovato sempre più largo impiego anche in ambito biologico ed ecologico, come strumento di indagine strutturale su suolo, animali e piante che affianca e completa tecniche tradizionali come la microscopia ottica ed elettronica.

La micro tomografia RX, grazie alle sue peculiarità, sta assumendo un ruolo fondamentale quale strumento di indagine. Utilizzata da sola o meglio ancora in sinergia con tecniche microscopiche classiche e di indagine fisiologica, può migliorare la comprensione dei complessi meccanismi che regolano lo sviluppo e la funzionalità degli organismi viventi.

Grazie alla non distruttività, questa tecnica permette anche di effettuare analisi in vivo e ripetute nel tempo, consentendo di monitorare le variazioni temporali di morfologia e fisiologia degli organi delle piante (radici, tronco, rami, foglie, gemme, infiorescenze, infruttescenze). Tra le specie arboree, il genere Vitis (Vitaceae) è stato spesso utilizzato come pianta modello nello studio di vari aspetti biologici, in particolare rispetto allo sviluppo strutturale e alla conduzione idraulica nel continuum radice – fusto – tralci – foglie.

La micro tomografia a raggi X

La μCT è una tecnica di visualizzazione digitale tridimensionale non distruttiva di oggetti solidi. Grazie all’interazione tra le parti costituenti il campione e un fascio di raggi X, dalla scansione tomografica del campione da ispezionare è possibile ottenerne il modello volumetrico, in un tempo relativamente ridotto e senza alcuna forma di contatto. Questo modello riproduce la complessità delle caratteristiche interne ed esterne del campione e permette di analizzarle visivamente e di misurarle senza la necessità di sezionare o alterare il componente, cosa spesso non possibile con tecniche di analisi tradizionali.

Un sistema di micro tomografia RX è costituito da una sorgente di raggi X, un porta campione rotante, un sistema di acquisizione del segnale costituito da un detector formato da una serie di sensori disposti a formare una griglia bidimensionale ed infine da una unità di elaborazione dei dati per la loro visualizzazione e analisi.

Figura 1: principali componenti del sistema di micro tomografia a raggi X utilizzato nell’investigazione, e campione di vite di quattro anni in analisi.

Il passaggio dei raggi X (figura 1), focalizzati sul piano di rotazione del campione, determina fenomeni fisici di dispersione e assorbimento che ne provocano la parziale attenuazione, mentre la frazione trasmessa raggiunge il detector. Le componenti attive dei sensori, eccitate dai raggi X, emettono a loro volta dei fotoni che sono raccolti da sensori e registrati come serie di pixel. Sono in tal modo generate immagini di sezioni bidimensionali (2D) del campione, per ogni frazione di angolo di rotazione (in totale 180° o 360°). 

L’elaborazione tramite potenti algoritmi computazionali della serie di proiezioni raccolte durante l’analisi permette di creare una ricostruzione volumetrica tridimensionale completa del campione, rappresentato da “voxels - volumetric picture elements o volume x elements” in scala di grigi, riproducendo fedelmente le relazioni spaziali che intercorrono tra le organizzazioni cellulari che costituiscono i tessuti e gli organi vegetali. 

I livelli di grigio corrispondono quindi a differenti gradi di attenuazione dei raggi X nel loro passaggio attraverso il campione. Regioni che assorbono meno raggi X appariranno come voxel scuri mentre, invece, aree fortemente assorbenti appariranno invece come voxel bianchi o grigio chiaro.

Applicazioni della μCT allo studio anatomico di campioni vegetali.

Le componenti che costituiscono le strutture anatomiche della pianta, in particolare la cellulosa, assorbono facilmente i raggi X con una marcata differenza di attenuazione, e quindi contrasto, rispetto all’aria. L’alta definizione delle immagini ottenute, rende quindi la tecnica tomografica un mezzo ideale nello studio dei tessuti legnosi disidratati.

Più difficoltosa invece risulta la visualizzazione di campioni di piante vive e di organi fortemente idratati, a causa del minor contrasto dovuto alla presenza di soluzione acquosa nei tessuti fibrosi e parenchimatici. In questi casi però l’utilizzo di tecniche avanzate, come quelle a contrasto di fase abbinate all’utilizzo di luce di sincrotrone, permettono di avere contrasti sufficienti per l’identificazione e caratterizzazione micrometrica di tessuti idratati.

Lo studio dell’organizzazione spaziale dei vasi di conduzione xilematica e floematica di un organismo vegetale è molto sfidante, data la complessità e le ridotte dimensioni delle strutture che concorrono a formare i vasi stessi. Storicamente molti sforzi sono stati rivolti alla comprensione di questi temi e vari gruppi di ricerca si sono cimentati in questo campo, anche con un crescente impiego di tecniche di micro tomografia a raggi X e relativi software di analisi delle immagini ottenute.

Il sistema vascolare di una pianta non segue uno sviluppo in linee rette ma, al contrario, è ricco di curvature e di strette interconnessioni tra vasi. È quindi facile comprendere come sia impossibile, nella preparativa di un campione per analisi di microscopia classica, allineare il taglio, effettuato mediante microtomo, tangenzialmente o radialmente ad un vaso o addirittura ad un gruppo di vasi e seguirne lo sviluppo in tutta la loro lunghezza, nel tentativo di ricostruirne tridimensionalmente la struttura anatomica. Appare quindi evidente come una tecnica di ricostruzione tridimensionale per immagini quale la tomografia, si presti bene a questo tipo di investigazioni.

Tra le specie vegetali la vite presenta aspetti caratteristici del suo sistema xilematico e floematico determinati dalla sua natura lianosa che porta allo sviluppo di vasi larghi, lunghi e relativamente isolati tra loro. Per questi aspetti la vite è un modello ideale per studi che utilizzino tecniche di visualizzazione per immagini, soprattutto rivolti alle dinamiche dello sviluppo strutturale e della conduzione linfatica indotte da condizioni di stress idrico.

Caso studio su campioni di Vitis vinifera

Su una serie di ceppi di vite (cultivar Brachetto) di quattro e venti anni di età sono state effettuate analisi di micro tomografia computerizzata a raggi X. I campioni selezionati erano rappresentativi della caratteristica evoluzione delle strutture legnose indotta dalle modalità di potatura utilizzate nel corso della vita delle piante. La particolare evoluzione nel tempo della strategia di potatura e della forma di allevamento avevano determinato uno sviluppo e una riorganizzazione dei tessuti legnosi molto interessanti. Le analisi sono state eseguite a distanza di alcuni mesi dall’espianto su campioni disidratati, presso il laboratorio metrologico "Labormet Due S.r.l." (Torino, Italia) con un potente (risoluzione con dettaglio fino a 1 μm) e versatile tomografo General Electric "Phoenix V - tome - X M”.

L’analisi tomografica ha permesso la ricostruzione della complessa organizzazione anatomica del sistema di trasporto xilematico, con dettagli a livello microscopico non ottenibili con tecniche tradizionali. 

La figura 2 mostra la rappresentazione tridimensionale della regione di inserzione della branca laterale del campione di quattro anni e una relativa sezione radiale del ceppo.  La regione tridimensionale rappresentata in trasparenza, evidenzia vasi con uno sviluppo lineare lungo l'asse verticale del ceppo che assumono una distribuzione molto complessa con cambio di direzione in corrispondenza dell'inserzione del tralcio laterale che alimentano. Parte dei vasi del ceppo sono orientati verso la sezione inferiore della branca e alcuni di questi a loro volta sono deviati radialmente, verso la sezione superiore, secondo un modello orchestrato dalla vite per costruire il sistema di vasi xilematici del tralcio in via di sviluppo. Allo stesso tempo, i vasi del ceppo non coinvolti nell'alimentazione della branca laterale mantengono una direzionalità verticale e sono ridistribuiti lungo il loro sviluppo per dare omogeneità e continuità al sistema di vasi xilematici della porzione distale della pianta. Quanto osservato riflette le modalità di riorganizzazione dei tessuti che si verifica in seguito alla formazione di una gemma e alla sua successiva evoluzione in germoglio - tralcio - branca col progredire delle fasi fenologiche e degli interventi di potatura annuali.

Figura 2: rappresentazione solida e in trasparenza del campione di vite di quattro anni (sinistra) e relativa proiezione di un piano di sezione radiale (destra). L’analisi μCT permette la ricostruzione dettagliata tridimensionale della morfologia esterna e della complessità di sviluppo dei vasi xilematici, oltre che il dettaglio in sezione delle componenti strutturali principali. Evidenti le occlusioni presenti in molti vasi xilematici dei primi tre anni di sviluppo (frecce rosse).

Il forte contrasto in assorbimento di raggi X tra i tessuti legnosi e l'aria ha permesso di evidenziare con ottima risoluzione (20 μm) le componenti strutturali principali nel campione di vite di quattro anni. Nella sezione radiale, infatti, sono ben visibili il midollo centrale, la successione di sviluppo annuale (da 1 a 4 in figura), i raggi midollari, il lume dei vasi xilematici e la regione anulare esterna del floema (figura 2). Di particolare interesse è la presenza di vasi xilematici occlusi nei tessuti dei primi tre anni di sviluppo della vite, con maggiore incidenza nella regione del secondo anno, assenti invece in quella dell'ultima stagione vegetativa. Questa caratteristica è stata osservata lungo tutto lo sviluppo della porzione di ceppo indagata e anche lungo le branche laterali. 

Il sistema di conduzione della pianta, infatti, si adatta dinamicamente alle variazioni delle condizioni di disponibilità idrica e di nutrienti ed evolve nel tempo, modificando l'efficacia della conduzione idrica, fino alla perdita definitiva della stessa.

L'assenza di occlusioni nei vasi sviluppati durante l'ultima stagione di crescita suggerisce che la loro presenza possa dipendere da eventi che si verificano successivamente all'anno di sviluppo del tessuto interessato. I vasi si occludono e perdono la funzionalità a causa di emboli o di produzione e accumulo di gomme, gel o tille. La formazione di queste occlusioni può essere innescata da eventi di disidratazione ed embolia, in risposta ad attacchi di patogeni o anche come conseguenza di un modello di senescenza dei vasi più vecchi, secondo il quale ad un iniziale sviluppo pre-funzionale segue un breve periodo di funzionalità di conduzione idraulica ed uno successivo post-funzionale, nel quale i tessuti assumono un ruolo strutturale. La capacità di regolare la produzione di nuovi vasi e di occludere i vasi vecchi, è stata proposta come fine meccanismo utilizzato dalla pianta per modulare lo sviluppo in funzione delle sue esigenze idriche, da un lato, e dell’andamento delle condizioni meteorologiche, dall'altro.

Le analisi tomografiche hanno anche fatto emergere importanti aspetti dell’evoluzione delle caratteristiche strutturali delle piante a seguito della successione delle potature. La vite infatti necessita di potature annuali per controllarne la naturale tendenza a ramificare seguendo uno sviluppo verticale. Indipendentemente dal sistema di allevamento adottato, i tralci vengono quindi periodicamente tagliati per portare la pianta ad una dimensione gestibile e per rinnovare i capi a frutto, regolando in questo modo l’equilibrio tra crescita vegetativa e produzione. In seguito al taglio si ha un progressivo degrado della porzione di legno ad esso sottostante, secondo meccanismi di disseccamento e necrosi attivati dalla pianta. Il volume (cono) di disseccamento è proporzionale al diametro della sezione recisa e diventa un potenziale sito di ingresso per patogeni che colonizzano i tessuti morti e che possono ulteriormente spostarsi verso porzioni vitali della pianta. In questo modo, l'infezione delle ferite può evolvere determinando un ampliamento delle aree di tessuto legnoso morto e, influenzando negativamente lo stato di salute della vite, causarne il declino.

Le analisi μCT hanno evidenziato in modo dettagliato lo sviluppo dei coni di disseccamento, sfruttando il marcato contrasto tra i tessuti morti e quelli che erano ancora vivi nelle piante prima del loro espianto. La minore densità dei tessuti morti determina, come detto, un minore assorbimento dei raggi X che, di conseguenza, appaiono nelle immagini tomografiche più scuri di quelli vivi.

Il campione di vite di venti anni era rappresentativo del degrado indotto dalla potatura. Il metodo adottato nella prima parte di vita della pianta era, infatti, basato su ripetuti tagli annuali, tipicamente concentrati sulla parte apicale del ceppo (figura 3). Le aree di disseccamento, moltiplicatesi nel corso degli anni, avevano portato allo sviluppo di un'ampia zona di legno morto, compromettendone la funzionalità. 

Figura 3: rappresentazione solida e in trasparenza del campione di vite di venti anni (sinistra) e relativa proiezione di un piano di sezione longitudinale (destra). Si può apprezzare la totale compromissione della parte distale del ceppo (frecce gialle) e lo sviluppo successivo della branca laterale (frecce verdi) in seguito al cambio di tecnica di potatura. Su questa sono inseriti coni di disseccamento (frecce rosse) dovuti a tagli di ritorno concentrati sulla parte dorsale che però non compromettono la continuità del flusso linfatico che può scorrere nei vasi ventrali non compromessi.

Considerando la necessità di rinnovare la parte viva della vite, negli ultimi otto anni di vita della pianta il sistema di potatura originale era stato modificato e prevedeva la formazione di due branche contrapposte, originate da gemme dormienti presenti sulla porzione ancora viva del tronco. Con questa tecnica, che provocava l'allontanamento graduale del capo a frutto dal ceppo alternandolo bilateralmente, si voleva evitare che i tagli invasivi si concentrassero su un'unica porzione di tronco, promuovendo uno sviluppo equilibrato della pianta e limitando la formazione di coni di disseccamento di grandi dimensioni. La potatura, inoltre, era stata ottimizzata selezionando i capi a frutto nella parte dorsale della branca, concentrando su questa i coni di disseccamento. Questo permetteva di preservare una buona sezione ininterrotta di legno vivo lungo la porzione ventrale, mantenendo una fluida conduzione linfatica. Questa tecnica, però, era stata solo parzialmente efficace, poiché negli anni era stato necessario contenere l'espansione laterale delle branche per evitarne l’affastellamento con quelle delle piante adiacenti, determinato dalla ridotta distanza tra le piante adottata all’impianto del vigneto. I tagli di ritorno che si erano resi necessari nel corso degli anni, avevano comunque determinato la formazione di evidenti coni di disseccamento, che però interessavano la parte superiore della branca e non la sua parte viva e conduttiva.

La forte criticità associata al taglio di una porzione di vite è emersa chiaramente anche nel campione di quattro anni, dove il forte impatto dei disseccamenti sulla struttura della giovane pianta era ben evidente (figura 4). Se esternamente i vari tagli di impostazione e potatura potevano apparire localizzati e ben rimarginati, internamente invece la compromissione coinvolgeva una parte significativa e critica dei tessuti. In particolare dal taglio di impostazione della branca laterale (“T2” in figura 4) si originava un disseccamento direttamente collegato al midollo della stessa, che si approfondiva in questo fino al ceppo. Numerose situazioni analoghe si erano verificate in vari altri punti di potatura, ad esempio nel taglio indicato come “T1” in figura 4.

Figura 4: rappresentazione solida e in trasparenza del campione di vite di quattro anni (sinistra) e relativa proiezione di un piano di sezione longitudinale (destra). Si nota la complessità dello sviluppo e della riorganizzazione dei vasi xilematici lungo l’asse del ceppo e nelle regioni di inserzione della branca laterale e di potatura. Evidente l’impatto del taglio di potatura di formazione della branca laterale (T2) che crea un cono di disseccamento direttamente collegato al midollo.

Qualsiasi taglio può quindi determinare meccanismi critici di degradazione dei tessuti che danneggiano parti di pianta che, invece, dovrebbero essere conservate per mantenerne vivi e funzionali gli organi.

Il dibattito su questi temi è di attualità ed evidenzia la necessità di utilizzare per la potatura di allevamento e di produzione, tecniche che mirino a preservare il più possibile la vitalità dei tessuti e del sistema vascolare, limitando lo sviluppo dei coni di disseccamento in numero e dimensione, favorendo la longevità delle piante, la resistenza ai patogeni del legno e l'efficienza produttiva del vigneto.

Conclusioni

Le analisi condotte su campioni di vite hanno dimostrato l'efficacia della tecnica di micro tomografia computerizzata a raggi X nel rivelare importanti e dettagliate informazioni tridimensionali relative ad aspetti anatomici e fisiologici di un organismo vegetale. 

Le analisi hanno permesso di ricostruire l’architettura delle strutture esterne e interne delle piante di vite, e dei vasi xilematici in particolare, e di ottenere  informazioni relative ai complessi fenomeni di risposta della vite alla potatura. Si è infatti visto, con elevato grado di dettaglio, come la pianta riorganizzi i propri tessuti a seguito dei tagli e come isoli i tessuti adiacenti ai tagli producendo coni di disseccamento sottostanti che compromettono la funzionalità dei tessuti vivi. Questo ha permesso anche di evidenziare la criticità della gestione della potatura che, manipolando la naturale tendenza evolutiva della pianta, altera il suo equilibrio vegetativo e il suo stato di salute. 

L’integrazione della micro tomografia a raggi X con altre (per esempio molecolari) nello studio della fisiologia della vite potrebbe portare a una migliore comprensione dei complicati meccanismi che regolano le funzioni di organi e tessuti, in particolare rispetto alla risposta della pianta a condizioni di stress biotici e abiotici.

Ad oggi la strumentazione tomografica non è impiegabile in campo ma si possono effettuare indagini in vivo e ripetute nel tempo su piante allevate in vaso. Analogamente a quanto esemplificato in questo testo, osservazioni effettuate prima e dopo la potatura, potrebbero evidenziare le dinamiche di sviluppo delle gemme adiacenti ai tagli, ricostruendo la formazione e l'organizzazione dei vasi xilematici del nuovo germoglio in crescita. Contemporaneamente si potrebbero documentare i meccanismi attivati dalla pianta per isolare i tessuti adiacenti al taglio mediante la formazione di coni di disseccamento.

Le informazioni ottenute potrebbero fornire elementi utili ad affinare le tecniche di potatura manuale della vite, con lo scopo di preservare un'efficiente conduzione della linfa e limitare le ferite che deteriorano i tessuti e li rendono più sensibili alla colonizzazione da parte di patogeni del legno. Una comprensione più dettagliata di questi aspetti, integrata da informazioni genetiche e fisiologiche, potrebbe facilitare l’evoluzione delle tecniche agronomiche, con l'obiettivo di preservare la salute del vigneto per tempi prolungati e garantirne un miglior equilibrio vegeto - produttivo.

Bibliografia.

Codato Simone, “Tecniche strumentali di micro tomografia a raggi X applicate allo studio dell’agroecosistema vigneto”, Relazione Finale, Laurea in Viticoltura ed Enologia, Università degli Studi di Torino, A.A. 2018 - 2019.

Ringraziamenti.

Gli autori ringraziano  il Sig. Riccardo Girelli, titolare del laboratorio metrologico Labormet Due S.r.l., per aver concesso l’utilizzo gratuito della strumentazione tomografica e il responsabile della sala metrologica, Sig. Giorgio Vattasso, per la grande disponibilità e l’alta professionalità dimostrate nell’esecuzione delle analisi.