Studio dei meccanismi responsabili delle differenze di suscettibilità delle varietà di vite alla Flavescenza dorata

N. BERTAZZON, P. BAGNARESI, V. FORTE, E. MAZZUCOTELLI, L. FILIPPIN, D. GUERRA, A. ZECHINI, L. CATTIVELLI, S. CASARIN, E. ANGELINI

CREA -Centro di Ricerca Viticoltura ed Enologia- 31015 Conegliano (TV)

CREA -Centro di Ricerca Genomica e Bioinformatica- 29017 Fiorenzuola D’Arda (PC)

Riassunto

Le varietà di Vitis vinifera manifestano una diversa suscettibilità alla Flavescenza dorata (FD), suggerendo l’esistenza di specifici tratti genetici associati alla resistenza a questa malattia. Nel presente studio vengono investigate, a livello di espressione genica, le modalità con cui due varietà diversamente suscettibili alla malattia, Chardonnay e Tocai friulano, rispondano all’attacco da parte dell’insetto vettore, Scaphoideus titanus, e del fitoplasma agente causale della FD. E’ emersa una differenza di base nelle vie di difesa delle due varietà, già prima che l’insetto e il fitoplasma raggiungano la pianta, e tali differenze vengono amplificate dall’infezione con il fitoplasma. Questi meccanismi molecolari suscitano nelle due varietà risposte di difesa diverse per tipologia e per tempistica, e ne definiscono la differente suscettibilità alla malattia. In particolare, sembra che nella varietà suscettibile il fitoplasma della FD induca l’inibizione della via di difesa dell’acido giasmonico, garantendosi in questo modo il successo nell’infezione.

Articolo estratto dalla presentazione di Nadia Bertazzon in occasione della prima edizione dell''Enoforum Web Conference (23-25 Febbraio 2021)

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Introduzione

La Flavescenza dorata (FD) è una malattia epidemica nella vite, di quarantena nella Comunità Europea, scoperta alla fine degli anni 1950 in Francia e ora presente in buona parte dell’Europa. È una delle malattie più dannose nei vigneti, con severe conseguenze economiche per i maggiori Paesi produttori viti-vinicoli. Ne derivano infatti ingenti perdite di produzione, sia a livello quantitativo che qualitativo, nonché il progressivo declino e deperimento delle piante.

La FD è causata da un fitoplasma, batterio senza parete appartenente alla famiglia dei Mollicutes, e viene trasmessa in modo molto efficiente dall’insetto vettore Scaphoideus titanus, cicalina di origine americana e molto diffusa soprattutto nei vigneti del Nord Italia.

La lotta alla FD è basata principalmente sull’adozione di specifiche strategie di prevenzione e protezione fitosanitaria, obbligatorie in Europa (Direttiva 2000/29/CE del Consiglio, e successive modifiche), fondate soprattutto su trattamenti insetticidi per il contenimento del vettore. Nonostante ciò, la malattia conquista ogni anno nuovi territori sia in Italia che in Europa, e spesso si verificano anche recrudescenze in zone colpite da tempo, come sta accadendo nell’ultimo triennio in Veneto. Nell’ottica di un’agricoltura più sostenibile, le tecniche di lotta tradizionalmente usate dovrebbero però essere affiancate da approcci più moderni, ad esempio l’uso di elicitori delle difese della vite e / o lo sviluppo di piante resistenti alla malattia.

In natura sono state osservate notevoli differenze nella suscettibilità delle diverse varietà di Vitis vinifera alla FD: alcune, come Chardonnay e Pinot grigio, mostrano danni molto gravi da fitoplasmosi, mentre altre, come Tocai friulano o Moscato bianco, manifestano i sintomi in un numero ridotto di piante e limitatamente a pochi tralci, pur essendo sottoposte alla stessa pressione di malattia. Non è noto se le differenze di suscettibilità osservate possano essere causate anche dalla preferenza del vettore o dal suo comportamento alimentare (Schvester et al., 1967; Boudon-Padieu, 1996; Borgo e Angelini, 2002; Maixner et al., 2006; Pavan et al., 2012; Eveillard et al., 2016).

Per progredire nella comprensione dei meccanismi di difesa attivati in varietà scarsamente sensibili, è di fondamentale importanza esaminare la risposta della pianta durante la fase iniziale dell'infezione, nell’interazione trofica specie-specifica che coinvolge il fitoplasma della FD, la vite e il vettore, sebbene questo tipo di analisi sia molto difficile.

Nel presente lavoro sono stati studiati i meccanismi trascrittomici che si attivano nelle prime fasi dell’infezione da parte della FD, con lo scopo di risalire ai fattori genetici che possono influenzare la suscettibilità e la resistenza ai fitoplasmi nella vite.

Materiali e metodi

Il piano sperimentale ha previsto l’uso di piantine micropropagate di due varietà di vite, l’allevamento di esemplari di S. titanus e l’utilizzo di una fonte di inoculo proveniente dal vigneto, con lo scopo di mimare in condizioni controllate gli eventi che hanno luogo nel normale corso di infezione.

Nel dettaglio, sono state valutate due varietà di vite caratterizzate da diversa suscettibilità ai giallumi: T. friulano clone ISV6 e Chardonnay clone R8. Ciascuna varietà è stata esposta a tre condizioni: i) al vettore infettivo (FDSt); ii) al vettore sano (HSt); iii) in assenza del vettore (noSt, tesi ‘controllo’) (figura 1). Ogni tesi è stata riprodotta in tre repliche biologiche, ciascuna formata di una coppia di piantine micropropagate. I campioni raccolti per le analisi erano costituiti dall’intera piantina, e sono stati prelevati in due tempi differenti: a tre (prima piantina di ciascuna coppia) e sei giorni (seconda piantina) dall’inserimento del vettore. 

Negli esperimenti di trasmissione sono stati usati insetti allevati in condizioni controllate. Le neanidi al primo stadio, ottenute da materiale legnoso raccolto da un vigneto molto infestato, sono state divise in due gruppi: il primo è stato alimentato con foglie di vite raccolte da piante di vite sane, il secondo è stato alimentato con foglie fresche infette dalla FD, prelevate da piante di vite coltivate in campo. Per le prove di trasmissione due esemplari di S. titanus (quinto stadio giovanile o adulti), entrambi sani (HSt) o infettivi (FDSt), sono stati messi su ogni coppia di piantine micropropagate ed è stato permesso loro di nutrirsi per tre giorni. Per ciascuna coppia la prima piantina è stata raccolta e congelata dopo tre giorni (3 dpi) dall’inserimento del vettore, mentre la seconda piantina dopo sei giorni (6 dpi).

Dalle piantine è stato estratto l’RNA totate, che è stato in seguito sottoposto a sequenziamento (RNA-Seq) tramite piattaforma “Illumina”. Il sequenziamento ha generato una serie di corte sequenze, chiamate “read”, di lunghezza media di 300 paia di basi, che sono state allineate sul genoma di V. vinifera di riferimento. Queste corte sequenze sono state utilizzate per costruire i profili di espressione dei geni che sono stati poi comparati determinando i geni differenzialmente espressi (DEGs) in modo statisticamente significativo tra le due varietà nelle diverse condizioni (noSt, HSt e FDSt).

Figura 1. Diagramma illustrante l’allevamento, l’infezione di S. titanus (NoSt: assenza di vettore; HSt: sani; FDSt: infettivi) in condizioni controllate e le prove di trasmissione. Vengono indicate le fasi di raccolta per l’analisi delle piantine e degli insetti durante l’esperimento (dpi: giorni post-infestazione).

Risultati

Le differenze di espressione costitutive tra Chardonnay e T. friulano

La comparazione dei profili di espressione genica di Chardonnay e T. friulano in assenza dell’insetto vettore ha messo in evidenza un’elevata differenza costitutiva tra le due varietà: sono stati individuati 6233 DEGs, dei quali circa la metà con un livello di espressione più alto in T. friulano (3046). La maggior parte di questi geni sono risultati coinvolti in meccanismi di risposta agli stress e in vie del metabolismo secondario. In particolare, T. friulano ha mostrato un livello di espressione costitutivamente più alto sia di geni codificanti per proteine legate al riconoscimento dei patogeni e per proteine di difesa (PR-protein), sia di numerosi geni del metabolismo secondario, coinvolti in particolare e nella biosintesi di monolignoli e stilbeni e nel metabolismo fenolico, che porta alla biosintesi dei flavonoidi, coinvolti soprattutto nella produzione di flavoni, flavonoli e antocianine. Infine, sono state osservate differenze trascrizionali significative tra le due varietà per un gruppo di geni coinvolti nella biosintesi degli ormoni, nella loro mobilitazione e nella trasduzione di segnali. In particolare, molti geni coinvolti nella biosintesi dell’acido giasmonico (JA) erano più espressi in T. friulano: otto geni codificanti per lipossigenasi (LOX), enzima chiave della prima parte generale della via degli ottodecanoidi, che porta alla produzione di giasmonati e di un gruppo di ossilipine chiamate “green leaf volatiles” (GLV); e due geni codificanti per acido osso-fitodienoico reduttasi (OPR), enzima specifico per la sintesi di JA.

Le risposte di Chardonnay e T. friulano all’attacco del fitoplasma della FD e del suo vettore S. titanus

Per studiare la risposta messa in atto dalle due varietà di vite all’attacco di S. titanus sani (HSt) o infettivi (FDSt), i profili dei trascritti ottenuti dalle piante di queste due tesi sono stati confrontati con quelli ottenuti dai controlli (tesi noSt), in modo da identificare i cambiamenti trascrizionali dovuti rispettivamente all’interazione pianta-insetto (HSt) e all’interazione tri-trofica tra pianta-insetto-fitoplasma (FDSt). Nella tabella 1 vengono indicati il numero di DEGs individuati.

La risposta delle due varietà all’attacco del fitoplasma della FD è stata molto diversa sia nelle tempistiche che nella tipologia. Nelle primissime fasi dell’infezione (a 3 dpi) è stata osservata una modulazione genica molto significativa in T. friulano (1735 DEGs), riguardante, in particolare, la trascrizione di molti geni coinvolti nel metabolismo della parete cellulare, codificanti enzimi per la biosintesi di elementi di parete, come la cellulosa sintasi, o implicati nella degradazione/ modificazione della parete cellulare, come la xiloglucano endotransglicosilasi (XTH) e la pectina liasi.

Al contrario, in Chardonnay una risposta consistente all’attacco di FD è stata rilevata solo dopo 6 giorni (1471 DEGs), comprendente la sovra espressione di numerosi geni della via dei fenilpropanoidi come la fenilalanina ammonia liasi e la cinnamato 4-idrossilasi, oltre a diverse stilbene sintasi e laccasi. Invece la risposta all’attacco di FDSt in Chardonnay a 3 dpi è risultata contenuta (460 DEGs). D’altra parte, in Chardonnay a 3 dpi è stata rilevata una significativa risposta provocata dall’infestazione di HSt (1656 DEGs). Quest’ultima comprendeva la sovraespressione di diversi geni coinvolti in vie di percezione e trasduzione degli stimoli ambientali per l’avvio della risposta di difesa basale della pianta, come i ricettori chinasici (RLK) e le proteine leganti il calcio. Inoltre, l’attacco di HSt ha indotto la trascrizione di molti geni coinvolti nella sintesi di tre ormoni (JA, etilene (ET) e acido abscissico (ABA)) e nelle risposte mediate da questi ormoni, coinvolte nella regolazione degli stress e della risposta ai patogeni.

Al contrario, nella risposta di Chardonnay all’infezione di FDSt è stato osservato un numero molto più basso di DEGs coinvolti nelle vie di trasduzione di ET e JA (figura 2). Per esempio, tra i geni coinvolti nella risposta di difesa mediata da JA, 10 erano differenzialmente espressi in seguito all’infestazione di HSt, mentre solo un gene LOX era modulato dopo l’infezione di FDSt. Similmente, tra i geni implicati nella difesa mediata da ET, rispettivamente 20 e nove geni sono risultati modulati dopo l’infestazione di HSt e FDSt. Anche la trascrizione di sette su nove geni implicati nella via di biosintesi e di risposta dell’ABA è risultata depressa.

Una risposta della stessa tipologia, ma quantitativamente molto più attenuata, è stata osservata anche in T. friulano, dove l’infestazione di HSt ha invece modificato poco l’espressione dei geni coinvolti nelle vie di trasduzione mediate da ormoni.

Tabella 1. Numero di geni modulati (DEGs), sovraregolati o sottoregolati, nella risposta di Chardonnay e Tocai friulano dopo tre o sei giorni (dpi) dall’attacco di S. titanus sani (HSt) o infettivi (FDSt) messi a confronto con la tesi controllo (noSt).

Figura 2. Modulazione di geni coinvolti in meccanismi di risposta a stress biotici a tre giorni dall’attacco di S. titanus sani (HSt) o infetti (FDSt) in Chardonnay. Sono illustrate le principali vie di percezione e trasduzione del segnale e alcune risposte di difesa. Il colore rosso indica i geni sovraespressi e il blu i geni sottoespressi.

Discussione e Conclusioni

In questo lavoro, i meccanismi coinvolti nella suscettibilità e nella resistenza alla FD di Chardonnay e T. friulano sono stati investigati prendendo in considerazione le risposte trascrizionali messe in atto dalle due varietà in seguito all’infezione. Il piano sperimentale utilizzato in questo studio, che includeva tre trattamenti (vettore infettivo, vettore sano e assenza di vettore), ha permesso di ottenere i profili dei trascritti delle diverse risposte della vite. Questo approccio ha consentito di indagare per la prima volta l’espressione genica costitutiva delle due varietà a diversa suscettibilità Chardonnay e T. friulano, nonché la modulazione dell’espressione della vite elicitata dalla puntura di S. titanus infetti e sani e infine l’effetto indotto dal fitoplasma della FD nei primi stadi di infezione, permettendo quindi la dissezione dell’interazione pianta-patogeno-vettore a livello molecolare.

In generale, le piante possiedono due tipi principali di strategia di difesa: meccanismi passivi o preesistenti, che coinvolgono barriere strutturali, quali cuticole spesse o riserve di composti antimicrobici, e meccanismi di difesa attivi, che vengono indotti in seguito al superamento delle barriere strutturali da parte dei patogeni.

La presenza di meccanismi di difesa passivi è stata studiata mediante la comparazione di piante non infette cresciute e mantenute in condizioni controllate identiche. L’analisi comparativa dei profili dei trascritti costitutivi (noSt) ha rivelato che Chardonnay e T. friulano possiedono un background genetico molto diverso, comprendente molti DEGs coinvolti in vie del metabolismo secondario. Vari geni potenzialmente associati con meccanismi di difesa delle piante contro stress biotici e abiotici hanno mostrato un’espressione preferenziale in T. friulano, suggerendo per questa varietà il possibile coinvolgimento di strategie di difesa costitutive contro S. titanus e/o il fitoplasma della FD.

I cambiamenti trascrizionali indotti dall’infestazione di S. titanus sani o infetti si sono rivelati differenti nelle tempistiche e nella tipologia di geni di difesa coinvolti. In particolare, l’infezione di FD causa nella varietà parzialmente resistente rapidi e ampi cambiamenti dei trascritti, che inducono l’espressione delle difese sin dalle prime fasi di infezione, basate soprattutto sul rimodellamento della parete cellulare. All’opposto, la varietà suscettibile è caratterizzata da un’attivazione ritardata di strategie di difesa, consistenti principalmente nell’induzione della sintesi di fitoalessine, tipica reazione di difesa riportata per ospiti suscettibili (Kuc, 2006).

In particolare, in Chardonnay, a tre giorni dall’infezione, sono avvenuti ampi cambiamenti dei trascritti in risposta all’insetto sano, mentre la risposta di difesa a S. titanus infetto, risultante dall’interazione pianta-patogeno-insetto, è apparsa molto più limitata. Infatti, in risposta all’insetto sano è stata osservata chiaramente l’attivazione di diverse vie di trasduzione del segnale, mediate dal calcio e dagli ormoni JA, ET ed ABA, che, però, non è più stata evidenziata dopo l’infezione di FDSt. Nel complesso i dati riportati in questo lavoro indicano che nella varietà suscettibile, il fitoplasma della FD induce un’inibizione della via di difesa del JA, garantendosi in questo modo il successo nell’infezione.

La metodologia impiegata in questo studio ha permesso di individuare i meccanismi che possono essere coinvolti nella suscettibilità e parziale resistenza di queste due varietà, ma non i sovrastanti caratteri genici specifici. Il primo passo per l’identificazione dei geni associati alla resistenza alla FD consiste nella ricerca di tratti genetici quantitativi (QTL) nelle popolazioni segreganti ottenute tramite la tecnica dell’incrocio. A tale scopo un lavoro avviato nel 2011 e attualmente in corso nell’ambito del progetto europeo TROPICSAFE, si basa sullo studio della progenie derivante dall’incrocio di Chardonnay e T. friulano, segregante per gli specifici caratteri di suscettibilità/resistenza alla FD. I risultati relativi ai geni differenzialmente espressi nelle due varietà, riportati nel presente lavoro, verranno integrati in una mappa genetica, e, insieme ai dati fenotipici, cioè di risposta in campo alla malattia, permetteranno di circoscrivere i tratti cromosomici contenenti i geni di interesse per la resistenza alla malattia. Queste informazioni potranno essere utilizzate per lo sviluppo di piante resistenti alla FD o nella selezione assistita da marker per la produzione di varietà di vite meno suscettibili alla FD.

Dal presente lavoro è emerso che la via di difesa mediata dal JA sembra avere un ruolo cruciale nella protezione nei confronti di sintomi di fitoplasmosi in vite. Sulla base di questa informazione è nato il progetto regionale MIDIFENDO (Regione Veneto, P.S.R. 2014- 2020, DGR 736/2018 - Misura 16.1.1 e Misure collegate), che prevede l’utilizzo di composti organici volatili microbici (mVOC) capaci di attivare preventivamente la via dello JA, con lo scopo di indurre nella vite le vie di difesa necessarie per proteggersi contro l’infezione del fitoplasma responsabile di FD.

Riassunto

Le varietà di Vitis vinifera manifestano una diversa suscettibilità alla Flavescenza dorata (FD), suggerendo l’esistenza di specifici tratti genetici associati alla resistenza a questa malattia. Nel presente studio vengono investigate, a livello di espressione genica, le modalità con cui due varietà diversamente suscettibili alla malattia, Chardonnay e Tocai friulano, rispondano all’attacco da parte dell’insetto vettore, Scaphoideus titanus, e del fitoplasma agente causale della FD. E’ emersa una differenza di base nelle vie di difesa delle due varietà, già prima che l’insetto e il fitoplasma raggiungano la pianta, e tali differenze vengono amplificate dall’infezione con il fitoplasma. Questi meccanismi molecolari suscitano nelle due varietà risposte di difesa diverse per tipologia e per tempistica, e ne definiscono la differente suscettibilità alla malattia. In particolare, sembra che nella varietà suscettibile il fitoplasma della FD induca l’inibizione della via di difesa dell’acido giasmonico, garantendosi in questo modo il successo nell’infezione.

Lavori citati

Borgo M., Angelini E., 2002. Diffusione della flavescenza dorata della vite in Italia e relazioni con vitigni, pratiche agronomiche e materiali di propagazione. Atti Giornate Fitopatologiche, 1, 35–50.

Boudon-Padieu E., 1996. Grapevine yellows induced by phytoplasmas. Diagnosis, epidemiology and research. Comptes rendus de l'Académie d'Agriculture de France, 82, 5–20.

Eveillard S., Jollard C., Labroussaa F., Khalil D., Perrin M., Desqué D., Salar P., Razan F., Hevin C., Bordenave L, Foissac X., Masson J.E. Malembic-Maher S., 2016. Contrasting susceptibilities to Flavescence Dorée in Vitis vinifera, rootstocks and wild Vitis species. Frontiers in Plant Science, 7, 1–12.

Kuc J., 2006. What’s old and what’s new in concepts of induced systemic resistance in plants, and its application. In: Multigenic and induced systemic resistance in plants. Tuzun S, Bent E, editors. Springer New York. 9–20.

Maixner M., Langer M., Gerhard Y., 2006. Epidemiological characteristics of Bois noir type I. Atti del XV Meeting ICVG, 86–7.

Pavan F., Mori N., Bressan S., Mutton P., 2012. Control strategies for grapevine phytoplasma diseases: factors influencing the profitability of replacing symptomatic plants. Phytopathologia Mediterranea, 2012;51:11–22.

Schvester D., Carle P., Moutous G., 1967. Essais de sensibilité de cépages à la flavescence dorée par inoculation avec Scaphoideus littoralis Ball. Ann Epiphyties, 18, 143–50.

Questo lavoro è stato tratto dall’articolo:

Bertazzon N., Bagnaresi P., Forte V., Mazzucotelli E., Filippin L., Guerra D., Zechini A., Cattivelli L., Angelini E., 2019. Grapevine comparative early transcriptomic profiling suggests that Flavescence dorée phytoplasma represses plant responses induced by vector feeding in susceptible varieties. BMC Genomics, 20, 526.