Fermentazione di mosto per Amarone con il lievito INVERNO 1936

Lo scopo dell’analisi consiste nel dimostrare l’effettiva dominanza del ceppo INVERNO 1936 nella conduzione della fermentazione alcolica del vino Amarone. La prova è stata svolta procedendo secondo le seguenti fasi operative:

• Prelievo di campioni di mosto in 3 momenti della fermentazione alcolica (piede, fase tumultuosa, fine fermentazione)
• Isolamento di specie lievitiformi su piastre di terreno WL agar
• Conta cellulare differenziale e selezione di colonie di lievito, rappresentative della popolazione cresciuta su piastra
• Caratterizzazione molecolare delle colonie selezionate per definirne la specie e confronto molecolare con il profilo reference (Inverno 1936)

Per la fase si isolamento i campioni di mosto sono stati opportunamente diluiti utilizzando tubi sterili con soluzione fisiologica (NaCl 9%) e poi seminati in piastre di terreno WL agar. La semina è stata effettuata in doppio e le piastre sono state incubate a 27°C per 5 giorni. In seguito le piastre aventi dalle 5 alle 200 ufc/mL sono state impiegate per la conta differenziale e per la selezione delle colonie rappresentative del campione.
 

Materiali e metodi: analisi molecolare

• Le colonie selezionate sono state caratterizzate mediante la tecnica PCR per le regioni interdelta.
• Il DNA di ogni lievito è stato estratto e amplificato mediante PCR, in seguito separato su gel d’agarosio. Il profilo di bande, specifico di ogni lievito selezionato, è stato quindi confrontato con quello del ceppo di riferimento.
• Nelle foto dei profili: R indica il profilo del lievito di riferimento mentre le colonie selezionate sono indicate con un numero progressivo. M indica il marcatore molecolare

RISULTATI DELL’ISOLAMENTO ED ANALISI MOLECOLARI

Piede di fermentazione:

Conta cellulare compresa tra 6 x 104 ufc/mL e 10 x 104 ufc/mL. Selezionate 4 colonie di 73 (piastra diluizione -2 A); 5 colonie di 59 (piastra dil -2 B); 4 colonie di 13 (piastra dil -3 A) e 4 colonie di 8 (piastra dil -3 B) per un totale di 17 colonie. Presenza di colonie di specie saccharomyces, specie non-saccharomyces e muffe.

Dalle piastre del campione piede di fermentazione sono state selezionate 17 colonie. Qui sopra sono riportate le foto di alcune piastre, fronte e retro, e di alcune colonie selezionate e numerate.

PCR interdelta Su 17 colonie analizzate: 9 colonie hanno un profilo identico al reference mentre 4 molto simile; 2 colonie presentano un profilo diverso ma appartenente alla specie S. cerevisiae; 2 colonie non mostrano bandeggio quindi appartengono al genere non-saccharomyces
 

Fase tumultuosa:

Conta cellulare compresa tra 5 x 107 ufc/mL e 7 x 107 ufc/mL. Selezionate 8 colonie di 43 (piastra dil -5 A); 7 colonie di 59 (piastra dil -5 B); 3 colonie di 11 (piastra dil -6 B) per un totale di 18 colonie. Una morfologia predominante.

Dalle piastre del campione in fase tumultuosa sono state selezionate 18 colonie. Qui sopra sono riportate le foto di alcune piastre, fronte e retro, e di alcune colonie selezionate e numerate

PCR interdelta Su 18 colonie analizzate: 14 colonie hanno un profilo identico al reference; 3 colonie presentano un profilo diverso ma appartenente alla specie S. cerevisiae; 1 colonia non mostra bandeggio quindi appartiene al genere non-saccharomyces
 

Fine fermentazione:

Conta cellulare compresa tra 1,60 x 107 ufc/mL e 1,95 x 107 ufc/mL. Selezionate 5 colonie di 15 (piastra dil – 5 A); 5 colonie di 22 (piastra dil -5 B) per un totale di 10 colonie. Unica morfologia presente.

Dalle piastre del campione in fase tumultuosa sono state selezionate 10 colonie. Qui sopra sono riportate le foto di alcune piastre, fronte e retro, e di alcune colonie selezionate e numerate

PCR interdelta Su 10 colonie analizzate: 9 colonie hanno un profilo identico al reference; solo 1 colonia non mostra bandeggio quindi appartiene al genere nonsaccharomyces

Conclusione

• Nel campione piede di fermentazione, più del 50% delle colonie sembrerebbe corrispondere al lievito INVERNO 1936. In questa fase sono comunque presenti anche specie nonsaccharomyces e qualche colonia di saccharomyces indigena.
• Nella fase tumultuosa il lievito INVERNO 1936 è dominante sulla popolazione saccharomicetica presente, dalle analisi differenziali delle piastre le colonie del lievito inoculato rappresentano il 95% delle colonie totali.
• Nella fase finale è confermata la presenza quasi assoluta del lievito INVERNO 1936

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