A. Deroite, M. Bastien, A. Dumont, A. Silvano, J.M. Heras y A. Ortiz-Julien
Lallemand Oenology, www.lallemand.com
Resumo
LEVEL2 SALVA™ é uma nova levedura não-Saccharomyces da espécie Suhomyces pyralidae usada como uma bioproteção específica contra a Brettanomyces bruxellensis durante as etapas pré-fermentativas da produção de vinho. LEVEL2 SALVA™ produz o Fator de Inibição Brettanomyces específico Spkt1, que interrompe a parede celular da Brettanomyces. O nosso estudo demonstra a sua eficácia na redução de populações de Brettanomyces e na produção de fenóis voláteis. Pode ser usada em vários estágios de pré-fermentação, incluindo em uvas colhidas até o enchimento da cuba. Além disso, LEVEL2 SALVA™ permite uma redução da utilização de SO2 sem comprometer a estabilidade e a qualidade do vinho, oferecendo uma alternativa natural para gerir a contaminação por Brettanomyces.
Introdução
A Brettanomyces bruxellensis é um microrganismo de deterioração bem conhecido no vinho, uma vez que o seu desenvolvimento leva à produção de aromas indesejáveis. Os fenóis voláteis produzidos durante a contaminação por Brettanomyces estão associados a defeitos no vinho, como mostrado na Tabela 1. Mesmo em baixas concentrações, abaixo do seu limiar de percepção, a presença desses compostos pode diminuir a intensidade aromática dos vinhos e esconder a sua tipicidade.
A Brettanomyces bruxellensis pode ser encontrada em diferentes etapas do processo de vinificação. Também pode estar presente em vinhas, mesmo em parcelas específicas dentro de uma vinha. Estudos anteriores estabeleceram claramente a presença de Brettanomyces bruxellensis em várias vinhas e em diferentes fases do desenvolvimento da uva após o pintor (Renouf et al., 2007).
1. Controlo clássico contra a Brettanomyces
A ferramenta mais comum para evitar contaminações por Brettanomyces bruxellensis é a adição de SO2. No entanto, de acordo com Avramova et al (2018), os fenómenos de adaptação levaram a que a subpopulação de Brettanomyces bruxellensis ficasse resistente ao SO2. Com a tendência de diminuir inputs, incluindo sulfitos, é importante encontrar soluções alternativas para prevenir e inibir o desenvolvimento de B. bruxellensis durante a produção e o armazenamento do vinho, além de considerar esta potencial resistência ao SO2.
2. O interesse de controlar a Brettanomyces nas etapas pré-fermentativas
Como a Brettanomyces também é encontrada antes do início da fermentação, é necessário ter uma abordagem preventiva para inibi-la e controlá-la usando uma bioproteção. Estas leveduras encontramse nas uvas, mesmo antes do processo de vinificação, conforme demonstrado por Renouf e Lonvaud-Funel (2007), que o detectaram em amostras colhidas em 4 vinhedos da área de Bordéus em diferentes fases de desenvolvimento da uva, entre o pintor e a colheita. Oro et al (2019) demonstraram a estreita relação entre estirpes de Brettanomyces bruxellensis da vinha e da adega com uma análise molecular (região 26S-D1/D2 da sequenciação de ADNr) de 62 amostras de uvas, ambientes vinícolas e mostos fermentados. Nessa investigação verificou-se que os isolados da vinha e da adega representavam biótipos dominantes e comuns, o que indicava que a vinha é uma fonte de contaminação de B. bruxelensis no ambiente vinícola. Mais recentemente, Pigao et al (2021) também isolaram a Brettanomyces bruxellensis em 12 dos 149 cachos de uva (amostragem de 2 anos) numa vinha em Oregon.
Atualmente, existem soluções de bioproteção com leveduras não-Saccharomyces nas etapas pré-fermentativas, no entanto, não são realmente eficazes contra a Brettanomyces.
3. Uma nova seleção não-Saccharomyces: LEVEL2 SALVA™
A Suhomyces pyralidae (anteriormente Candida pyralidae) IWBT Y1140 foi isolada num mosto de um Cabernet Sauvignon Sul-Africano (Mehlomakulu et al., 2014) pelo Instituto Sul-Africano de Investigação de Uva e Vinho (Universidade de Stellenbosch). Demonstrou-se que a Suhomyces pyralidae controla e inibe as estirpes B. bruxellensis encontradas no ambiente vitivinícola. Atualmente esta estirpe está disponível para os produtores de vinho com o nome LEVEL2 SALVA™.
Esta atividade inibidora específica é explicada pela produção de um Fator de Inibição da Brettanomyces, denominado Spkt1. Foi demonstrado que as suas condições ótimas de atividade são compatíveis com as condições de vinificação, principalmente em termos de pH e gama de temperatura. A sensibilidade desta estirpe ao etanol faz com que seja a etapa pré-fermentativa o momento de eleição para a sua aplicação (Mehlomakulu et al., 2014).
Conforme apresentado na Figura 1, a levedura LEVEL2 SALVA™ inibe a Brettanomyces bruxellensis sem impacto sobre o crescimento da Saccharomyces cerevisiae. Esta experiência além de confirmar a eficácia de LEVEL2 SALVA™ nas etapas de pré-fermentação em condições laboratoriais, também demonstra que a utilização exclusiva da levedura Saccharomyces, por vezes, não é suficiente para controlar o desenvolvimento de Brettanomyces.
Figura 1: Viabilidade durante a fermentação do mosto de uvas tintas (pH 3,5) a 20°C. 1.A Evolução da população em monocultura de Brettanomyces bruxellensis, LEVEL2 SALVA™ e Saccharomyces cerevisiae. 1.B Evolução da população em co-cultura.
3.1 Caracterização LEVEL2 SALVA™
LEVEL2 SALVA™ foi caracterizada pelo seu metabolismo de carbono, o seu consumo de NFA e a sua capacidade fermentativa. Com uma necessidade muito baixa de azoto e uma das menores capacidades
fermentativas de todas as nossas estirpes não-Saccharomyces, combinada com uma boa capacidade de implantação e crescimento, esta levedura é uma excelente candidata para a bioproteção do mosto de uva.
3.2 Mecanismo do Fator de Inibição Spkt1 da Brettanomyces
O Fator de Inibição Spkt1 da Brettanomyces produzido por LEVEL2 SALVA™ é provavelmente uma enzima que interrompe especificamente a parede celular da Brettanomyces bruxellensis. Esta hipótese foi confirmada por uma experiência (Figura 2), inoculando LEVEL2 SALVA™ e uma levedura Saccharomyces cerevisiae num meio sem fonte de carbono, mas contendo laminarina. Esta molécula de laminarina foi usada para imitar a parede celular da Brettanomyces. A Saccharomyces cerevisiae, sem fonte de carbono, não pode crescer. Com o seu fator inibidor da Brettanomyces, LEVEL2 SALVA™ foi capaz de hidrolisar a laminarina para usar uma fonte de carbono e crescer neste meio, demonstrando-se que este Fator de Inibição da Brettanomyces é produzido exclusivamente por LEVEL2 SALVA™
Figura 2 : Crescimento da Saccharomyces cerevisiae A (azul) e LEVEL2 SALVA™ (verde) avaliado através da DO600 num meio mínimo com laminarina.
Mehlomakulu et al., 2017 realizaram uma análise microscópica para validar o impacto do Fator de Inibição Spkt1 da Brettanomyces produzido por LEVEL2 SALVA™ na parede celular da Brettanomyces bruxellensis (Figura 3). Após 24h de tratamento, as estirpes de Brettanomyces apresentaram estrias, mostrando a degradação da membrana, enquanto as células não tratadas estavam lisas, apresentando uma membrana intacta.
Figura 3. Microscopia de varrimento de Brettanomyces bruxellensis (a) Controlo; (b) 24h após a exposição ao Fator de Inibição da levedura Brettanomyces produzido por LEVEL2 SALVA™ (Mehlomakulu et al. 2017). Imagens utilizadas com a autorização da Oxford Press.
4. Eficácia da bioproteção de LEVEL2 SALVA™ contra a Brettanomyces: validação em mosto de uva à escala laboratorial
LEVEL2 SALVA™ foi totalmente caracterizada tendo em conta vários parâmetros (taxa de inoculação, tolerância ao etanol, tolerância SO2, etc.) no nosso laboratório de Investigação em Blagnac, França, para determinar as condições ideais da utilização e produção do seu Fator de Inibição de Brettanomyces.
A cinética de fermentação demonstrou que a inoculação de LEVEL2 SALVA™ não teve nenhum impacto negativo na duração da fermentação.
Em comparação com um grupo controlo, LEVEL2 SALVA™ também foi capaz de inibir a Brettanomyces bruxellensis e limitar significativamente a produção de fenóis voláteis de 66 % a 91 %, dependendo do composto (Figura 4).
Figura 4. Produção de fenóis voláteis pela estirpe de Brettanomyces bruxellensis L0469 (CRBO, UMR 1366 Oeno): Saccharomyces cerevisiae (azul); LEVEL2 SALVA™ inoculada antes da Saccharomyces cerevisiae (vermelho). 1 L de Syrah na fase líquida (239,6 g/L de açúcar; 144 mg/L de NFA; pH 3,34) a 24 °C.
A eficácia e especificidade de LEVEL2 SALVA™ para inibir a Brettanomyces bruxellensis foi comparada com duas estirpes de não-Saccharomyces NS2 e NS4 encontradas no mercado, com base nas referidas propriedades de bioproteção. Um grupo de controlo negativo sem qualquer não-Saccharomyces também foi testado, bem como com Brettanomyces bruxellensis isolada. Todas as fermentações atingiram a secura com acidez volátil <0.3g H2SO4/L (dados não mostrados).
Brettanomyces bruxellensis foi inoculada a 1×103 UFC/mL e a sua viabilidade foi monitorizada durante as fermentações através do espalhamento em meio seletivo (Figura 5). A Saccharomyces cerevisiae, bem como a não-Sacchaomyces NS2 e NS4 não limitaram eficazmente o crescimento de Brettanomyce. LEVEL2 SALVA™ foi a única levedura capaz de reduzir a população de Brettanomyces.
Figura 5. Viabilidade da estirpe Brettanomyces bruxellensis L0469 – Mosto de uva comercial a 24 °C
5. Ensaios piloto e à escala de adega: aumento de escala
Foram realizados inúmeros ensaios à escala piloto e à escala de adega em diferentes castas de uvas tintas (Merlot, Cabernet sauvignon, Syrah, Tempranillo, etc.) em França, Espanha, Itália e nos Estados Unidos. LEVEL2 SALVA™ foi inoculada em diferentes etapas pré-fermentativas do processo de vinificação, incluindo as uvas e o enchimento dos depósitos.
5.1 Contaminação recorrente de parcelas de vinhas
Numa adega na Columbia Gorge AVA, WA, EUA, problemas recorrentes de Brettanomyces foram identificados como provenientes de uvas que tiveram origem em parcelas específicas das suas vinhas. Foi realizado um ensaio com 50% de cachos desengaçados de Syrah desta parcela identificada e transferidos de forma homogénea para depósitos de madeira de 40 hL (mesmo fornecedor, mesma idade). Durante o enchimento dos depósitos foi adicionado SO2 a 4g/hL. Posteriormente, LEVEL2 SALVA™ foi inoculada num depósito em comparação com o depósito do grupo controlo sem adição. Os depósitos não foram homogeneizados durante 24h a 14 °C, antes da inoculação de Saccharomyces cerevisiae. Ambos os depósitos seguiram o mesmo processo de vinificação, e os vinhos foram analisados no final da fermentação malolática (FML). Os vinhos onde LEVEL2 SALVA™ foi inoculada nas primeiras etapas apresentaram um nível muito baixo da população Brettanomyces (Figura 6).
Figura 6. Análise após o final da FML Ensaio em adega, Syrah, Columbia Gorge AVA, Estados Unidos.
5.2 Adição de LEVEL2 SALVA™ nas uvas após colheita
A levedura LEVEL2 SALVA™ também pode ser aplicada nas etapas iniciais da elaboração do vinho, mais especificamente nas uvas após colheita. Foi realizado um ensaio em Espanha em que LEVEL2 SALVA™ foi aplicada por pulverização em uvas Tempranillo colhidas manualmente, em comparação com uvas sem qualquer adição. O mesmo processo de vinificação foi aplicado para ambos os tratamentos. No final da FML, observámos que LEVEL2 SALVA™ foi capaz de limitar eficientemente o desenvolvimento de Brettanomyces (Figura 7), diminuindo por um fator 2,4 a sua população.
Figura 7. População Brettanomyces nos vinhos após a FML. Ensaio em adega num Tempranillo, Espanha. Comparação entre LEVEL2 SALVA™ inoculada por pulverização nas uvas e um grupo de controlo sem tratamento.
5.3 Contaminação precoce de Brettanomyces: eficiência de LEVEL2 SALVA™
Foi realizada uma experiência no laboratório de Microbiologia da Fundação Edmund March (San Michele all’Adige, Itália) em mosto líquido de uvas tintas (casta Rebo), inoculada com Brettanomyces a 1×103 ufc/mL. O Controlo foi inoculado com Saccharomyces cerevisiae com temperatura de fermentação < 27°C. Paralelamente LEVEL2 SALVA™ foi inoculada 48 horas antes da inoculação da Saccharomyces cerevisiae. No final da fermentação alcoólica verificou-se que o mosto inoculado com LEVEL2 SALVA™ apresentava baixas concentrações de 4-etifenol e 4-etilguaiacol em comparação com o controlo (figura 8).
Figura 8. Produção de fenois voláteis num mosto da casta Rebo com e sem LEVEL2 SALVA™ uma semana após o final da FML e sem adição de SO₂
5.4 Redução da utilização de SO2 com LEVEL2 SALVA™
Foi realizada uma experiência com a Universidade de Estudos de Udine (Itália) com Cabernet Franc. Após o esmagamento e desengace, o mosto com películas foi dividido de forma homogénea em três cubas de 25 L, onde a Brettanomyces foi inoculada a 1×103 UFC/mL. Um controlo sem adição foi comparado com um mosto com uma adição de 2,5 g/hL de SO2 e outro com uma adição de LEVEL2 SALVA™ (sem adição de SO2). No final da fermentação alcoólica, os fenóis voláteis foram analisados. Os níveis de 4-etilfenol e 4-etilguaiacol foram superiores no controlo sem SO2 e sem LEVEL2 SALVA™. Nesta experiência, a levedura LEVEL2 SALVA™ foi mais eficaz do que o SO2, uma vez que atingiu o nível mais baixo de fenóis voláteis (Figura 9).
Figura 9. Fenóis voláteis em Cabernet Franc (Universidade de Estudos de Udine, Itália) sem SO2, com adição de SO2 e sem SO2 mas com LEVEL2 SALVA™
Outro ensaio foi conduzido na casta Merlot, em Bordéus (França), comparando 5 g/hL de adição de SO2 a uma adição de LEVEL2 SALVA™ (sem adição de SO2), em ambos os casos foram adicionados no enchimento das cubas (tanques de aço inoxidável de 80 hL) antes de uma imersão a frio (3 dias a 10°C). Um acompanhamento em diferentes estágios (no final da FML e após 5 meses) mostrou uma presença de Brettanomyces no final da FML e um crescimento significativo após 5 meses, durante o envelhecimento, no controlo tratado com 5 g/hL de SO2. Não foram detetadas Brettanomyces nos vinhos com LEVEL2 SALVA™, após a FML nem após 5 meses. Esta inibição de Brettanomyces pela levedura LEVEL2 SALVA™ foi correlacionada com a ausência de fenóis voláteis nos tratamentos com LEVEL2 SALVA™. (Figura 10).
Figura 10. Brettanomyces e fenóis voláteis analisados em Merlot (Bordéus, França) com SO2 e sem SO2 mas com LEVEL2 SALVA™
6. Uma abordagem de bioproteção integral para controlar a Brettanomyces
Mesmo em níveis abaixo do seu limiar de percepção, os fenóis voláteis podem ter um impacto negativo no perfil sensorial, reduzindo a percepção da fruta, mascarando a identidade do vinho, a sua assinatura e o seu terroir. Em concentrações mais altas, leva claramente a uma depreciação qualitativa do vinho, com a presença de defeitos óbvios. Diferentes soluções naturais a aplicar durante as diversas etapas de vinificação (desde as uvas até à maturação do vinho) podem auxiliar na gestão de contaminações de Brettanomyces. LEVEL2 SALVA™ é uma solução de bioproteção específica que complementa as soluções naturais existentes.
Na vinha, LALVIGNE BOTRYLESS™ (quitosano de Aspergillus niger) aplicado no período pós-floração até à fase do pintor apresentou resultados interessantes para redução microrganismos de deterioração, incluindo a Brettanomyces.
Em adega, LEVEL2 SALVA™ é uma solução natural inovadora para prevenir a contaminação de Brettanomyces desde as etapas iniciais (uvas, antes do transporte, na recepção, etc..). LEVEL2 SALVA™ produz um Fator de inibição de Brettanomyces específico destruindo a parede celular desta levedura de contaminação Brettanomyces. Uma inoculação precoce de uma Saccharomyces cerevisiae selecionada e uma fermentação alcoólica “limpa” e bem gerida assumirá o controlo para ocupar o espaço microbiológico e evitar o desenvolvimento de Brettanomyces. A inoculação com bactérias selecionadas também é fundamental no processo de vinificação. A utilização de Lactiplantibacilus plantarum ML Prime™ resultará numa estabilização precoce dos vinhos, enquanto uma bactéria Oenococus oeni tem um efeito direto no controlo da população Brettanomyces e impede a produção de fenóis voláteis. Dependendo da viabilidade do processo de vinificação e dos objetivos do enólogo, tanto a co-inoculação quanto as inoculações sequenciais podem ser interessantes. NO BRETT INSIDE™ (solução à base de quitosano) também é uma excelente ferramenta curativa no caso do desenvolvimento de Brettanomyces durante a maturação. A combinação dessas alternativas naturais ao SO2 oferece boas oportunidades naturais aos enólogos quando se trata de gerir as contaminações de Brettanomyces e mitigar as suas consequências na qualidade do vinho, preservando sua assinatura e a identidade do terroir do vinho.
Conclusão
Este artigo demonstra a eficácia da nova levedura não-Saccharomyces LEVEL2 SALVA™ atuando como um agente de bioproteção específico contra a Brettanomyces bruxellensis nas fases pré-fermemntativas da elaboração do vinho. O mecanismo de inibição, impulsionado pelo Fator de Inibição da Brettanomyces Spkt1, degrada efetivamente a parede celular das Brettanomyces, diminuindo significativamente a sua população.
Ensaios Laboratoriais e ensaios pilotos confirmam que LEVEL2 SALVA™ reduz significativamente a produção de fenóis voláteis, o que é crucial para manter a qualidade do vinho. Os ensaios também destacam a versatilidade da levedura LEVEL2 SALVA™, mostrando a sua eficácia quando aplicada em várias etapas do processo de vinificação, inclusive em uvas após colheita e durante o enchimento das cubas.
Além disso, a redução da utilização de SO2 sem comprometer a estabilidade do vinho realça o potencial de LEVEL2 SALVA™ apresentando-a como uma alternativa sustentável na vinificação. Globalmente, LEVEL2 SALVA™ oferece uma solução robusta e natural para gerir a contaminação de Brettanomyces, alinhando-se com o movimento do setor vitivinícola no sentido de reduzir os inputs de químicos e promover a conservação da qualidade do vinho.
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