Brettanomyces em enologia: fisiologia e mecanismos de alteração

Porque Brettanomyces continua a ser um problema em aberto

Embora Brettanomyces bruxellensis tenha sido objeto de intensa investigação científica durante mais de vinte anos, continua a ser um dos microrganismos mais temidos na adega. A sua plasticidade biológica faz com que cada situação seja um caso particular: uma mesma prática enológica pode produzir resultados completamente diferentes consoante a estirpe presente, o perfil químico do vinho e a fase produtiva considerada.

A difusão do problema aumentou à escala global nos últimos quinze anos. Em Itália, até ao final da década de 2000, Brettanomyces não era considerada uma prioridade de gestão nas adegas; hoje, a situação mudou radicalmente, com contaminações documentadas também em vinhos jovens e em zonas tradicionalmente pouco expostas.
O principal fator favorecedor é a alteração climática: o aumento do pH médio das uvas — consequência de vindimas mais tardias e de teores de açúcar elevados — tornou muitos vinhos estruturalmente mais favoráveis ao desenvolvimento de Brettanomyces. Com um pH superior a 3,5, a levedura multiplica-se de forma eficaz, enquanto o dióxido de enxofre perde progressivamente a sua fração molecular ativa, reduzindo drasticamente o seu poder antimicrobiano com a mesma dose adicionada.

Fisiologia de Brettanomyces: semelhanças e diferenças em relação a Saccharomyces

Do ponto de vista taxonómico, o termo Brettanomyces bruxellensis e o seu sinónimo Dekkera bruxellensis referem-se à mesma espécie: Dekkera é a forma ascosporogénica, enquanto Brettanomyces é a forma não esporogénica. No vinho, isola-se quase exclusivamente a forma não esporogénica, uma vez que as condições enológicas não permitem a esporificação. A literatura científica utiliza ambos os nomes de forma intercambiável.

Brettanomyces partilha com Saccharomyces cerevisiae algumas características fundamentais: metabolismo anaeróbio facultativo, capacidade fermentativa, tolerância ao etanol — superior à de muitas leveduras não-Saccharomyces, com crescimento documentado até teores alcoólicos de 13–14% vol. — e resistência aos sulfitos. Isto distingue-a claramente da maioria das leveduras selvagens.
No entanto, as diferenças são igualmente significativas: Brettanomyces cresce lentamente na presença de elevadas concentrações de açúcar — o mosto em fermentação ativa não é o seu habitat ótimo —, assimila fontes de carbono alternativas aos açúcares simples, incluindo o etanol e o glicerol, e está perfeitamente adaptada a sobreviver na presença de oxigénio, colonizando eficazmente as superfícies de madeira das barricas e os equipamentos de adega.

O seu genoma, sequenciado em 2011, conta com cerca de 3.000 genes, dos quais 2.600 são ortólogos dos de Saccharomyces cerevisiae. Entre os genes funcionalmente caracterizados encontram-se os da fenilacrilato descarboxilase (PAD) e da vinilfenol redutase (VPR) — as duas enzimas centrais na produção de fenóis voláteis —, bem como um conjunto de genes de resposta ao stress que diferem significativamente dos seus homólogos em Saccharomyces, o que explica a maior resiliência de Brett no ambiente do vinho.

A via enzimática dos fenóis voláteis

A PAD e os vinilfenóis

O primeiro passo da biossíntese é catalisado pela fenilacrilato descarboxilase (PAD), que converte os ácidos hidroxicinâmicos presentes no vinho — ácido p-cumárico em 4-vinilfenol, ácido ferúlico em 4-vinilguaiacol.
É importante sublinhar que a PAD não é exclusiva de Brettanomyces: estirpes indígenas de Saccharomyces cerevisiae com caráter POF+ (Phenolic Off-Flavour positive) possuem esta enzima e podem produzir vinilfenóis durante a fermentação. No entanto, os vinilfenóis apresentam limiares de perceção sensorial relativamente elevados e, por si só, não provocam um desvio organolético relevante.

A VPR: o marcador exclusivo de Brettanomyces

A vinilfenol redutase (VPR) converte os vinilfenóis em etilfenóis: 4-vinilfenol em 4-etilfenol, 4-vinilguaiacol em 4-etilguaiacol. Estes compostos apresentam limiares de perceção sensorial claramente inferiores — na ordem dos 140–440 μg/L para o 4-etilfenol — e são responsáveis pelo odor característico a estábulo, couro, animal molhado e fumado associado ao defeito provocado por Brett.
A VPR é atualmente considerada um marcador funcional exclusivo de Brettanomyces: não foi identificada atividade comparável em nenhum outro microrganismo enologicamente relevante.

A expressão e a atividade da VPR variam consideravelmente de estirpe para estirpe, o que explica por que nem todas as contaminações produzem o mesmo nível de alteração sensorial. Um trabalho de Lorenza Conterno demonstrou que cerca de 1 estirpe em cada 6 de Brettanomyces não produz fenóis voláteis em quantidades percetíveis, apesar de possuir os genes para o fazer: é a expressão génica, e não a simples presença do gene, o fator discriminante na patogenicidade específica de cada estirpe.

O perfil sensorial completo: para além dos etilfenóis

O perfil de alteração produzido por Brettanomyces é mais complexo do que apenas os etilfenóis. Em condições de acesso ao oxigénio, Brett produz ácido acético em quantidades significativas, uma vez que o seu metabolismo se modifica no sentido oxidativo na presença de O₂; em condições normais de gestão da adega, a produção é mais limitada, mas pode contribuir para aumentos inesperados da acidez volátil.
As tetrahidropiridinas (THP), responsáveis pelo chamado mouse taint, constituem outra classe de compostos associada a Brett, embora estudos recentes — incluindo uma análise de 2023 — tenham evidenciado que o defeito surge mais frequentemente na presença de consórcios microbianos que incluem Lactobacillus spp. e estirpes selvagens de Oenococcus oeni.
Brett contribui ainda para a produção de aminas biogénicas, como histamina e tiramina, com relevância tanto organolética como toxicológica.

Este cenário composto impõe que não se atribuam automaticamente a Brettanomyces todos os off-flavours animais ou fermentados detetados num vinho: é necessária uma abordagem analítica integrada — contagem microbiana, doseamento dos etilfenóis e identificação dos consórcios presentes — para um diagnóstico correto.

Ecologia e dinâmicas populacionais na adega

A questão sobre a origem primária de Brettanomyces — vinha ou adega — foi durante muito tempo debatida. Investigações recentes demonstraram, através de caracterização genética, que as estirpes isoladas da uva e as residentes na adega não apresentam diferenças genotípicas sistemáticas: uma mesma estirpe pode colonizar indiferentemente ambos os ambientes.
A primeira contaminação pode chegar através da uva, mas nos anos seguintes as duas fontes somam-se.

O momento de maior risco na cadeia situa-se na janela temporal entre o fim da fermentação alcoólica e o início da fermentação malolática: os açúcares estão esgotados ou quase esgotados, o etanol está presente, Saccharomyces está a perder vitalidade e o pH ainda não foi estabilizado com SO₂.
Com apenas 300 mg/L de açúcares residuais, Brett pode começar a multiplicar-se de forma eficaz. A sua capacidade de formar biofilmes na madeira — com penetração documentada até 6 mm na aduela — e de colonizar uniões, tubos e equipamentos torna-a um residente persistente na adega.

A variabilidade dependente da estirpe: o ponto central

A característica mais relevante do ponto de vista aplicativo é a extraordinária variabilidade intraespecífica de Brettanomyces. As estirpes diferem em quase todos os parâmetros enologicamente relevantes.
A tolerância ao SO₂ molecular varia significativamente: estudos australianos demonstraram a existência de estirpes capazes de crescer com 0,8 mg/L de SO₂ molecular em meio aquoso, e de outras já inibidas a 0,4 mg/L; a presença de etanol modifica ainda mais este quadro de forma específica de cada estirpe.
O equilíbrio entre a atividade da PAD e da VPR é igualmente variável: algumas estirpes acumulam predominantemente vinilfenóis, enquanto outras convertem quase instantaneamente cada intermediário em etilfenol, tornando-se muito mais perigosas com a mesma carga microbiana.

Um artigo particularmente significativo analisou o crescimento de cinco estirpes de Brettanomyces em mais de 50 vinhos tintos, agrupados de acordo com o seu perfil químico. Em vinhos «permissivos» — pH elevado e baixo teor de SO₂ livre —, todas as estirpes se multiplicavam de forma semelhante.
Em vinhos «restritivos», pelo contrário, as diferenças dependentes da estirpe emergiam com grande clareza: apenas uma estirpe mantinha a mesma dinâmica de crescimento agressiva, enquanto as outras quatro apresentavam cinéticas radicalmente diferentes.
O perfil químico do vinho interage com as características genéticas da estirpe de uma forma que não é previsível apenas com os parâmetros analíticos padrão.

Esta variabilidade tem uma consequência prática direta: o mesmo protocolo de gestão, aplicado em anos diferentes ou em adegas distintas com vinhos de perfil semelhante, pode conduzir a resultados opostos simplesmente porque a estirpe presente é diferente.
É por este motivo que, quinze anos após a sequenciação do genoma de Brett, ainda não existe uma estratégia universal e definitiva.

O estado viável mas não cultivável (VBNC)

Entre as características mais insidiosas de Brettanomyces está a capacidade de entrar num estado definido como VBNC (Viable But Non-Culturable), demonstrado pela primeira vez para esta levedura pelo grupo de Hervé Alexandre.
Neste estado, as células reduzem o seu volume, abrandam o metabolismo para níveis basais e perdem a capacidade de formar colónias em placa de Petri: não são detetáveis pelos métodos microbiológicos convencionais, mas permanecem viáveis e capazes de retomar a multiplicação assim que a pressão de stress cessa.
Num experimento emblemático, células tratadas com SO₂ e não detetáveis durante 11 dias consecutivos reapareceram e proliferaram após a remoção do SO₂ por stripping.

As implicações práticas são relevantes: uma contagem em placa negativa não constitui garantia de ausência de Brettanomyces viável.
O estado VBNC torna a monitorização microbiológica convencional potencialmente enganadora e sugere a adoção de técnicas complementares — PCR quantitativa e citometria de fluxo com corantes vitais — capazes de detetar as células independentemente do seu estado cultural.
A intensidade da resposta VBNC também varia entre estirpes, acrescentando um nível adicional de complexidade à gestão do risco.

Conclusões

Brettanomyces bruxellensis é um microrganismo que desenvolveu, na sua associação com o ambiente vitivinícola, um conjunto eficaz de adaptações: fontes de carbono alternativas, biofilmes na madeira, estado VBNC e resistência ao SO₂ dependente da estirpe.
A compreensão destes mecanismos não é um exercício académico, mas o pré-requisito indispensável para construir estratégias de controlo racionais.
O segundo artigo desta série aborda as ferramentas atualmente disponíveis — da bioproteção pré-fermentativa ao quitosano, da gestão do SO₂ molecular às perspetivas futuras da investigação aplicada — com o objetivo de fornecer ao enólogo um quadro operativo atualizado e cientificamente fundamentado.