L. Cappellin*, **, L. Ciotti*, M. Hutterli*,
*Tofwerk AG, CH-3645 Thun, Svizzera
**Università degli Studi di Padova, 35131 Padova, Italia
Abstract
La contaminazione del vino da 2,4,6-tricloroanisolo (TCA) causa consistenti perdite economiche nell’industria vitivinicola. Oltre 50 anni di ricerche hanno identificato il tappo di sughero come causa principale di questo problema. La soglia della percezione umana per il TCA è estremamente bassa: già 1-2 ng/L rendono il vino inaccettabile al palato. Contaminazioni inferiori a 0.5 ng/L sono considerate in genere trascurabili. Un metodo per evitare contaminazioni da TCA sarebbe lo screening preventivo dei tappi. La necessità di un metodo analitico rapido e non distruttivo per quantificare la contaminazione da tricloroanisolo nei tappi di sughero ha una enorme urgenza. I metodi analitici e sensoriali utilizzati comunemente presentano una scarsa affidabilità ed un alto numero di errori. In questo articolo, proponiamo un approccio analitico innovativo basato sulla spettrometria di massa a ionizzazione chimica a tempo di volo (CI-TOF) utilizzando il sistema “Vocus“. Questa tecnica si è dimostrata capace di quantificare il TCA in un tappo di sughero in soli 2 secondi, senza distruggere il tappo, con una sensibilità al di sotto della soglia di percezione. Il metodo è in grado di analizzare e quantificare il TCA in circa 10 milioni di tappi in un anno. Abbiamo dimostrato la sua applicabilità in ambiente industriale e la correlazione con i metodi standard per la quantificazione del TCA rilasciabile.
Introduzione
Il cosiddetto odore anomalo di tappo, principalmente causato dal 2,4,6-tricloroanisolo (TCA), rappresenta una minaccia significativa per l’industria vinicola, causando perdite annue superiori a 10 miliardi di dollari (Taylor et al., 2000). Nonostante la complessità del vino, dovuta alla presenza di centinaia di composti aromatici, anche pochi ng/L di TCA possono compromettere l’aroma. (Tarasov et al., 2017). La scoperta del TCA come responsabile di anomalie olfattive risale ai primi anni ’80 e, nonostante quattro decenni di ricerca, la comprensione completa della sua presenza nel vino resta ancora non del tutto chiara (Buser et al., 1982; Sefton e Simpson, 2005).
Sebbene il TCA sia il composto che rappresenta il problema maggiore, anche altri contaminanti del sughero possono portare alla contaminazione di un vino, ad esempio i cloro- o bromoanisoli (Chatonnet et al., 2004). Le origini del TCA nel sughero rimangono sconosciute, con possibili legami a biocidi clorofenolici o a composti naturali nel legno sottoposti a clorurazione e reazioni microbiche (Simpson e Sefton, 2007). Si è notato che l’incidenza del TCA è più elevata nelle foreste di quercia da sughero non gestite: questa osservazione giustificherebbe un collegamento tra le condizioni ambientali e la contaminazione microbiologica (Simpson e Sefton, 2007).
L’analisi del TCA nei tappi di sughero è ardua a causa della sua forte localizzazione e i metodi attuali sono spesso laboriosi e distruttivi (Prescott et al., 2005). L’analisi del TCA rilasciabile, secondo lo standard ISO 20752:2014, prevede l’immersione dei tappi di sughero in un simulante di vino e la successiva quantificazione mediante tecnica GCMS. Questi metodi sono principalmente usati come standard in laboratorio.
L’analisi sensoriale rimane una tecnica ampiamente utilizzata, ma questi metodi tradizionali sono soggettivi, richiedono molto tempo e sono soggetti a errori (Cork Stoppers – Sensory Analysis, ISO 22308:2005). La necessità di metodi rapidi e non distruttivi ha portato all’esplorazione della spettrometria di massa a ionizzazione chimica (CI-MS) come nuovo approccio (Lopez-Hilfiker et al., 2017).
Questo studio introduce il reattore Vocus basato sulla ionizzazione chimica (CI-MS), escludendo la cromatografia e utilizzando la spettrometria di massa ad alta risoluzione per la separazione in tempo reale dei segnali del TCA da quelli degli altri composti volatili emessi dai tappi di sughero naturale (Cappellin et al., 2020). Lo strumento Vocus ha dimostrato la capacità di rilevare concentrazioni di TCA al di sotto delle soglie sensoriali in soli 2 secondi, stabilendo al contempo una buona correlazione con le determinazioni del TCA rilasciabile (Taylor et al., 2000; ISO 20752:2023). Il metodo è stato ulteriormente convalidato in uno scenario industriale simulato, analizzando 10.100 tappi di sughero naturale in poche ore.
L’importanza del nuovo metodo risiede nella sua rapidità, nella sua natura non distruttiva e nella correlazione con gli standard consolidati, offrendo una possibile svolta per lo screening su larga scala del TCA nell’industria del sughero.
Materiali e metodi
Campioni di Tappi di Sughero
Campioni di tappi di sughero naturale, con un diametro di 24 mm e una lunghezza di 49 mm, sono stati ottenuti direttamente da vari produttori. Le valutazioni visive del sughero andavano da Flor a II in base alla guida internazionale. I tappi non erano rivestiti, dunque esenti dalla presenza di sostanze sintetiche. Le calibrazioni, i test del nuovo metodo e i confronti con altre tecniche di analisi del TCA sono stati condotti su tappi di sughero naturali provenienti da lotti diversi. I test industriali hanno coinvolto un lotto misto composto da 100 tappi di sughero naturale da diversi produttori e due lotti omogenei, ciascuno composto da 5000 tappi di sughero naturale dello stesso produttore.
Vocus Cork Analyzer (VCA)
Il VCA, sviluppato da Tofwerk AG, azienda tecnico-scientifica con sede in Svizzera, comprende uno spettrometro di massa ad alta risoluzione a ionizzazione chimica Vocus 2R abbinato a un campionatore automatico a spazio di testa dinamico specifico per i tappi di sughero. Il Vocus 2R raggiunge una risoluzione di massa fino a m/dm = 15.000. La sorgente di ioni reagenti era impostata a p ≈2 mbar e genera ioni reagenti da aria sintetica (Alphagaz 1 Air, Air Liquide). La camera di reazione è operata ad una pressione di 1,5 mbar e ad una temperatura di 150 °C. La ionizzazione chimica (CI), per trasferimento di carica, produce ioni TCA con una frammentazione trascurabile degli ioni del campione. Il campionatore automatico di tappi di sughero presenta singole cavità per evitare la contaminazione incrociata. Il VCA viene misurato per un tempo di 1,2 secondi in ogni cavità, aspirando aria a un flusso di 1 litro standard al minuto attraverso una linea di campionamento PTFE riscaldata (1/8 pollici i.d.) a 120 °C.
Simultaneamente, l’aria sintetica sostituisce il gas nello spazio vuoto campionato, con un tempo di stabilizzazione di circa 0,8 secondi tra le cavità, risultando in un periodo di ciclo totale di Δt = 2 secondi per ogni tappo di sughero. Benzene, toluene e xilene in azoto puro vengono miscelati nel flusso di aria del campione per monitorare la stabilità degli ioni primari. L’intensità del segnale dei picchi spettrali a 209,940 Th, 211,937 Th e 213,934 Th espressa in conteggi al secondo (cps), e, corrispondenti agli isotopi C7H5Cl3O+, viene sommata e utilizzata come segnale per il TCA. Il segnale del benzene C6H6+ viene utilizzato come standard interno per correggere eventuali derive di sensibilità. La conversione in TCA rilasciabile equivalente, espressa in ng/L, viene effettuata mediante calibrazione rispetto al metodo standard.
Analisi del TCA Rilasciabile secondo i Metodi Standard
Il TCA rilasciabile nei tappi di sughero naturali è stato determinato seguendo le norme o gli standard OIV-MA-AS315-16 e ISO 20752:2023, ma con una piccola modifica. Un tappo di sughero è stato immerso in una soluzione idroalcolica (12% v/v di gradazione alcolica) per 24 ore. I composti volatili nello spazio di testa sono stati raccolti utilizzando la micro-estrazione in fase solida, e un sistema GC-MS ha rilevato TCA e TCA-d5. Il metodo, ampiamente utilizzato nell’industria del sughero, è cruciale per dimostrare la contaminazione da TCA nei tappi di sughero, anche in contesti legali, e sarà indicato come “ISO” d’ora in avanti.
Risultati e Discussione
Considerando i tempi di misurazione molto rapidi per i singoli tappi di sughero, sono stati valutati tre gruppi di tappi naturali provenienti da produttori diversi per un totale di 10.100. I risultati per il set più piccolo, composto da 100 tappi naturali, sono riportati nella Figura 1. I tappi sono stati misurati sequenzialmente uno dopo l’altro e il tempo totale di misurazione per l’intero esperimento è stato di pochi minuti. Questo lotto includeva diversi tappi di sughero altamente contaminati da TCA, altri con solo una leggera contaminazione e altri ancora mostravano un segnale di TCA al di sotto della soglia di rilevabilità.
La Figura 2 riassume la quantificazione del TCA in due diversi lotti, ciascuno composto da 5000 tappi di sughero. Il tempo totale di misurazione dei due lotti è stato di poche ore. In termini di confronto, se lo stesso esperimento fosse stato condotto utilizzando il metodo ISO, avrebbe richiesto più di quattro mesi di analisi continua.
Inoltre, il presente metodo non è distruttivo e nessun danno visivo o di deformazione è comparso sui tappi di sughero. Pertanto, i campioni possono ancora essere utilizzati e venduti dopo l’analisi, a condizione che venga eseguito uno step di ricondizionamento per ripristinare il contenuto di umidità. Questa procedura è molto comune nell’industria del sughero. Gli istogrammi riportati nella Figura 2 indicano che il primo lotto è caratterizzato da un contenuto medio di TCA inferiore rispetto al secondo lotto. Oltre il 99% dei tappi di sughero era contaminato con <1 ng/L di TCA e circa il 50% con <0,5 ng/L di TCA, che è attualmente considerato un limite per i tappi di sughero privi di TCA nell’industria del sughero.
Al contrario, il secondo lotto aveva solo una percentuale trascurabile di tappi privi di TCA, mentre quasi tutti erano contaminati con >1 ng/L di TCA.
La presente tecnica può essere utile in uno scenario industriale per selezionare i tappi di sughero naturale in base al loro livello di contaminazione da TCA prima che vengano venduti o in un laboratorio di controllo qualità per valutare rapidamente l’incidenza del TCA nei lotti di sughero.
Confronto con ISO 20752:2023 e OIV-MA-AS315-16
Un insieme di 671 tappi di sughero naturale è stato testato con il nuovo metodo proposto e, per confronto, con il metodo ISO (ossia ISO 20752:2023 e OIV-MA-AS315-16). La Figura 3 riporta la correlazione tra Vocus e ISO per tali campioni. Il valore di R2 della regressione lineare è 0,92, implicando un coefficiente di correlazione di Pearson pari a 0,96. La correlazione è statisticamente significativa (p < 0,01). Per valutare meglio tali risultati di correlazione e avere un punto di riferimento, un set di tappi di sughero è stato misurato due volte secondo la norma ISO, aspettando un periodo di 15-30 giorni tra le misurazioni. L’R2 della retta di regressione è 0,68 e il coefficiente di correlazione di Pearson è quindi 0,82 (p < 0,01). Tali valori suggeriscono che la correlazione tra Vocus e ISO è fortemente limitata dalla precisione del metodo ISO. La grande incertezza associata al metodo ISO ha probabilmente origine nella fase di preparazione del campione, ovvero “la fase di ammollo”. In tale fase, ogni tappo di sughero naturale è sottoposto ad ammollo per 24 ± 2 ore in una soluzione simulante di vino. Eliminando la fase di ammollo, il Vocus Cork Analyzer ha il vantaggio di ridurre l’incertezza legata a questo passaggio.
Conclusioni
In questo articolo abbiamo presentato una nuova tecnica, con alta sensibilità, in Real-time e non distruttiva, per la quantificazione della contaminazione da TCA in singoli tappi di sughero. Questo approccio supera notevolmente le prestazioni dei metodi analitici esistenti in termini di velocità, avendo inoltre limiti di rilevabilità inferiori per il TCA. La nuova tecnica mostra inoltre un’ottima correlazione con la quantificazione del TCA rilasciabile utilizzando metodi standard. La nuova tecnica rappresenta una svolta per il settore del sughero e del vino, offrendo la possibilità di una preselezione ultra rapida (2s) di singoli tappi di sughero naturale basata sulla quantificazione della contaminazione da TCA. La tecnica può analizzare simultaneamente anche altri contaminanti quali cloroanisoli, clorofenoli, bromoanisoli e bromofenoli.
Per ulteriori informazioni, contattare: vca.info@tofwerk.com
Buser, H. R., et al. (1982). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 30(2), 359−362.
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Cork Stoppers – Sensory Analysis (ISO 22308:2005).
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